實驗步驟(編輯修改稿)
2024-11-09 17:39 本頁面
【文章內容簡介】 應中的抗原的質量，濃度以及抗原是否處于天然構象狀態(tài)。所以制備高質量的樣品以用于后續(xù)的抗體agarose beads孵育對免疫沉淀實驗是否成功非常關鍵。在這個環(huán)節(jié)中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4?完成外，最為關鍵的是裂解液的成份。用于免疫沉淀實驗的樣品一般是原代培養(yǎng)細胞裂解液或者細胞系裂解液。我們以常用的RIPA裂解液為例(，接近生理濃度下的NaCl，一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等)來說明其各主要成份的用途，進而幫助我們如何針對不同的實驗目的和不同的蛋白質特性來選擇最佳的裂解液。a(緩沖液:。b(NaCl濃度一般習慣用150 mM，這主要是因為150 mM接近生理濃度，不會破壞蛋白質之間的相互作用。然而細胞內部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM，150 mM的NaCl有可能會破壞這個區(qū)域的蛋白質相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋白的亞細胞定位而定。c(甘油由于其粘性，可以對蛋白質之間的相互作用起到一個很好的保護作用。一般添加10%的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質之間的相互作用。d(裂解液中的去垢劑可以裂解細胞質膜，也同時破壞了許多細胞器的膜，從而釋放了其中儲存的許多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀實驗的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來自胞質中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受到改變后從而恢復了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實驗非常關鍵。一般主要通過添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過Protease Cocktail(多種蛋白酶抑制劑混合物)可以抑制蛋白酶。e(去垢劑對于免疫沉淀實驗尤其是免疫共沉淀實驗是一個非常關鍵的因素。不同的去垢劑種類和不同的去垢劑濃度主要通過影響以下三個因素來影響免疫沉淀效果:細胞質/器膜的通透性:因為許多目的蛋白都定位在細胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來，抗體才能與之反應。膜蛋白的釋放:許多膜蛋白的構象對去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對這類蛋白的免疫沉淀實驗，需要謹慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。蛋白相互作用:不同去垢劑對不同性質的蛋白質的相互作用影響程度不一樣，需要根據具體蛋白的特性進行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應作用于何種蛋白質現在很難精準預測，所以一個更為切實可行的辦法就是通過具體實驗篩選合適的去垢劑種類和濃度。二、抗體agarose beads孵育裂解細胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲存在80?保存3個月，但最好能夠使用新鮮制備的細胞裂解液上清去進行抗體agarose beads孵育實驗?？贵w可以先加入上清中與樣品孵育數小時后再加入Protein A或者G beads孵育過夜，也可以同時加入抗體和Protein A或者G beads孵育過夜。一般選擇1mg總蛋白(1mg/ml)對應添加1 ug抗體，最高可以添加至5 ug抗體，過多的抗體會產生假陽性。這個步驟中關鍵因素在于選擇合適的陰性對照。一般選用加同樣量的IgG，但更為妥當的方法是選擇針對胞內其它無關目的蛋白的一抗做對照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，選擇膜蛋白B來做陰性對照，只要確認二者之間沒有相互作用。而做胞質可溶性蛋白C的免疫沉淀，則選擇另外一個可溶性蛋白D來做陰性對照。同時，為避免Protein A或者G beads有(非)特異性吸附從而造成免疫沉淀實驗結果的假陽性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預先將Protein A或者G beads與細胞裂解液孵育數小時，然后取上清用于后續(xù)的抗體agarose beads孵育。同時，Protein A或者G beads對不同類型的抗體親和力不同，結合一抗的種屬和Ig亞型，選擇合適的Protein A或者G beads也是決定免疫沉淀實驗成功與否的一個重要因素。一般推薦使用Protein A和Protein G beads的混合物，這樣可以達到最佳實驗效果，而且省去了許多選擇的煩惱。三、抗體agarose beads復合物洗滌: 除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對照外，去除免疫沉淀實驗非特異性的一個辦法是對抗體agarose beads復合物進行多次洗滌。一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來的非特異性吸附。針對不同的實驗要求，還可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類來達到去除非特異性吸附的效果。例如，針對單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實驗或者雖然是進行免疫共沉淀實驗，但蛋白質之間的結合比較牢靠，可以考慮使用低濃度(%)的SDS洗滌抗體agarose beads復合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。四、鑒定免疫沉淀實驗用途非常廣泛(見IP: Qamp。A)，而且基于最基本的免疫沉淀實驗衍生出了許多免疫沉淀相關實驗手段(比如免疫共沉淀，染色質免疫沉淀和RNA蛋白免疫沉淀)，因此，免疫沉淀實驗的鑒定方法主要視實驗目的而定。我們在本手冊中主要簡單概述常見的免疫沉淀之后的WB檢測需要注意的實驗環(huán)節(jié)。由于免疫沉淀實驗使用目的蛋白抗體加Protein A/G beads與樣品孵育，因此在最后離心獲得抗體agarose beads復合物后，eppendorf管中主要含有抗體，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特異性作用蛋白。其中，抗體和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之間是以非共價健結合在一起，只有Protein A/G與agarose beads是共價結合在一起的。因此，最后經過添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣SDSPAGE中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導致抗體的
物理相關推薦
鄂ICP備17016276號-1