實(shí)驗(yàn)步驟(編輯修改稿)
2024-11-09 17:39 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 應(yīng)中的抗原的質(zhì)量，濃度以及抗原是否處于天然構(gòu)象狀態(tài)。所以制備高質(zhì)量的樣品以用于后續(xù)的抗體agarose beads孵育對(duì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是否成功非常關(guān)鍵。在這個(gè)環(huán)節(jié)中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4?完成外，最為關(guān)鍵的是裂解液的成份。用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的樣品一般是原代培養(yǎng)細(xì)胞裂解液或者細(xì)胞系裂解液。我們以常用的RIPA裂解液為例(，接近生理濃度下的NaCl，一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等)來說明其各主要成份的用途，進(jìn)而幫助我們?nèi)绾吾槍?duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌牡鞍踪|(zhì)特性來選擇最佳的裂解液。a(緩沖液:。b(NaCl濃度一般習(xí)慣用150 mM，這主要是因?yàn)?50 mM接近生理濃度，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而細(xì)胞內(nèi)部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM，150 mM的NaCl有可能會(huì)破壞這個(gè)區(qū)域的蛋白質(zhì)相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋白的亞細(xì)胞定位而定。c(甘油由于其粘性，可以對(duì)蛋白質(zhì)之間的相互作用起到一個(gè)很好的保護(hù)作用。一般添加10%的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。d(裂解液中的去垢劑可以裂解細(xì)胞質(zhì)膜，也同時(shí)破壞了許多細(xì)胞器的膜，從而釋放了其中儲(chǔ)存的許多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來自胞質(zhì)中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受到改變后從而恢復(fù)了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對(duì)于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。一般主要通過添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過Protease Cocktail(多種蛋白酶抑制劑混合物)可以抑制蛋白酶。e(去垢劑對(duì)于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)尤其是免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。不同的去垢劑種類和不同的去垢劑濃度主要通過影響以下三個(gè)因素來影響免疫沉淀效果:細(xì)胞質(zhì)/器膜的通透性:因?yàn)樵S多目的蛋白都定位在細(xì)胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來，抗體才能與之反應(yīng)。膜蛋白的釋放:許多膜蛋白的構(gòu)象對(duì)去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對(duì)這類蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，需要謹(jǐn)慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。蛋白相互作用:不同去垢劑對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的相互作用影響程度不一樣，需要根據(jù)具體蛋白的特性進(jìn)行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應(yīng)作用于何種蛋白質(zhì)現(xiàn)在很難精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，所以一個(gè)更為切實(shí)可行的辦法就是通過具體實(shí)驗(yàn)篩選合適的去垢劑種類和濃度。二、抗體agarose beads孵育裂解細(xì)胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲(chǔ)存在80?保存3個(gè)月，但最好能夠使用新鮮制備的細(xì)胞裂解液上清去進(jìn)行抗體agarose beads孵育實(shí)驗(yàn)?？贵w可以先加入上清中與樣品孵育數(shù)小時(shí)后再加入Protein A或者G beads孵育過夜，也可以同時(shí)加入抗體和Protein A或者G beads孵育過夜。一般選擇1mg總蛋白(1mg/ml)對(duì)應(yīng)添加1 ug抗體，最高可以添加至5 ug抗體，過多的抗體會(huì)產(chǎn)生假陽性。這個(gè)步驟中關(guān)鍵因素在于選擇合適的陰性對(duì)照。一般選用加同樣量的IgG，但更為妥當(dāng)?shù)姆椒ㄊ沁x擇針對(duì)胞內(nèi)其它無關(guān)目的蛋白的一抗做對(duì)照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，選擇膜蛋白B來做陰性對(duì)照，只要確認(rèn)二者之間沒有相互作用。而做胞質(zhì)可溶性蛋白C的免疫沉淀，則選擇另外一個(gè)可溶性蛋白D來做陰性對(duì)照。同時(shí)，為避免Protein A或者G beads有(非)特異性吸附從而造成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預(yù)先將Protein A或者G beads與細(xì)胞裂解液孵育數(shù)小時(shí)，然后取上清用于后續(xù)的抗體agarose beads孵育。同時(shí)，Protein A或者G beads對(duì)不同類型的抗體親和力不同，結(jié)合一抗的種屬和Ig亞型，選擇合適的Protein A或者G beads也是決定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否的一個(gè)重要因素。一般推薦使用Protein A和Protein G beads的混合物，這樣可以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)效果，而且省去了許多選擇的煩惱。三、抗體agarose beads復(fù)合物洗滌: 除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對(duì)照外，去除免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非特異性的一個(gè)辦法是對(duì)抗體agarose beads復(fù)合物進(jìn)行多次洗滌。一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來的非特異性吸附。針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)要求，還可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類來達(dá)到去除非特異性吸附的效果。例如，針對(duì)單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)或者雖然是進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度(%)的SDS洗滌抗體agarose beads復(fù)合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。四、鑒定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)用途非常廣泛(見IP: Qamp。A)，而且基于最基本的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)衍生出了許多免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段(比如免疫共沉淀，染色質(zhì)免疫沉淀和RNA蛋白免疫沉淀)，因此，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的鑒定方法主要視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。我們?cè)诒臼謨?cè)中主要簡(jiǎn)單概述常見的免疫沉淀之后的WB檢測(cè)需要注意的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。由于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)使用目的蛋白抗體加Protein A/G beads與樣品孵育，因此在最后離心獲得抗體agarose beads復(fù)合物后，eppendorf管中主要含有抗體，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特異性作用蛋白。其中，抗體和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之間是以非共價(jià)健結(jié)合在一起，只有Protein A/G與agarose beads是共價(jià)結(jié)合在一起的。因此，最后經(jīng)過添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣SDSPAGE中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導(dǎo)致抗體的
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