western-blot實(shí)驗(yàn)方法步驟(編輯修改稿)
2025-06-16 00:51 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 轉(zhuǎn)膜 小心取下凝膠，把預(yù)先在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡過(guò)的 Whatman濾紙及硝酸纖維素膜切成與凝膠同樣大小，按次序疊放在一起，在 4度 100V電壓轉(zhuǎn)膜 1H,取出硝酸纖維素膜，右上角切去以作標(biāo)記，麗春紅染色，可見(jiàn)多條粉紅色條帶，再用 TBST漂洗至膜發(fā)白。 ? 封閉 稱取脫脂奶粉 1克，用 1 TBS溶解到 20ml，使脫脂奶粉濃度為 5％。將硝酸膜浸在 20ml封閉液中，室溫?fù)u 2h后。 實(shí)驗(yàn)步驟 ? 一抗雜交孵育 將一抗用含 5%脫脂奶粉的1 TBST溶液稀釋，使抗體濃度為 1:1000；將封閉過(guò)的膜放在一抗稀釋液中， 4度過(guò)夜；而后吸棄一抗稀釋液，用 1 TBST洗 3次，每次 5min。二抗孵育 ? 二抗雜交孵育：將辣根過(guò)氧化物酶連接的二抗用含 5%脫脂奶粉的 1 TBST溶液稀釋，使?jié)舛葹?:2021，并加入辣根過(guò)氧化物酶連接的抗生物素抗體（濃度為 1:1000），將膜置于二抗稀釋液中，室溫振蕩孵育 1h；而后吸棄二抗稀釋液，用 1 TBST洗 3次，每次 5min。 實(shí)驗(yàn)步驟 ? 顯影：將膜置入 10ml LumiGLO溶液中（ 10ml LumiGLO溶液配方為： 20 LumiGLO、 20 Peroxide、 MilliQ water），室溫輕搖 1分鐘，注意避光操作；在暗室中剪下與膜同樣大小的膠片，壓在暗盒中，約 1min；將膠片放在顯影液中洗 15min；水沖洗；定影液中洗 25min；水沖洗，可在相應(yīng)位置見(jiàn)到目的條帶。 疑難雜證 ? 沒(méi)有注明可以用來(lái)做 western blot的一抗，可以用來(lái)做 western blot嗎？ 不一定 ,因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的 ,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位的，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于 western blotting，因?yàn)樵?western blotting中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞。 疑難雜證 ? 做 western每次只加一種一抗，請(qǐng)教有人同時(shí)加兩種或者多種一抗的嗎？ 最好還是不要同時(shí)加兩種一抗。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號(hào)的話，就說(shuō)不清楚了。做 Western在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗， ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對(duì)照的一抗、二抗， ECL顯色、壓片、洗片。 曾經(jīng)做過(guò) Western在同一張膜上檢測(cè)兩種蛋白。因?yàn)檫@兩種目的蛋白的分子量相差較遠(yuǎn)，轉(zhuǎn)完膜后，一邊給Marker染色，一邊封閉。在上一抗之前，根據(jù) Marker的條帶把膜水平剪開(kāi)，分子量小的目的蛋白在下面半張，大的在上面半張。然后分別上一抗、二抗，檢測(cè)。 疑難雜證 ? western blot 使用的膜哪種最好啊， PVDF好還是NC膜，能介紹一下膜的選擇嗎？ PVDF膜價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。 NC膜價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如 PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 都可以用麗春紅染色。 具體使用還要參考相關(guān)文獻(xiàn) 疑難雜證 ? 做 western，在分子量很低的位置總是出現(xiàn)一條很強(qiáng)的帶（通常比我要的帶強(qiáng)），不知道為什么？是蛋白降解了嗎？ 有降解的可能，但如果用的是多抗出現(xiàn)非特異也是可能的，關(guān)鍵是你要的位置出現(xiàn)了嗎？ 減少非特異可以延長(zhǎng)
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