【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 曲霉素的檢測(cè)方法在食品檢測(cè)中極為重要。國(guó)內(nèi)外有關(guān)黃曲霉素B1 的檢測(cè)方法主要有:薄層色譜法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法、高效液相色譜法和熒光光度法。試驗(yàn)采用了免疫親和柱對(duì)飼料中黃曲霉素B1 進(jìn)行凈化,對(duì)高效液相色譜熒光檢測(cè)方法進(jìn)行了研究,為監(jiān)控飼料中黃曲霉素B1 提供了簡(jiǎn)便可行的方法。(TLC)薄層色譜法(TLC)是傳統(tǒng)的檢測(cè)AFB1 最常用方法,是應(yīng)用最早、最廣的分離、分析技術(shù),曾是我國(guó)測(cè)定食品及飼料中AFB1 的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法之一。此法所用的試劑、設(shè)備簡(jiǎn)單,費(fèi)用低廉,容易掌握,適用大量樣品的分離、篩選,一般的實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展,屬于定性和半定量的功能。靈敏度低、重現(xiàn)差、操作煩瑣、時(shí)間長(zhǎng)且安全性差等缺點(diǎn),已越來(lái)越不適用現(xiàn)代分析的要求。(HPLC)高效液相色譜法(HPLC)具有高效、快速、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測(cè)限低、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn),可同時(shí)分離多種黃曲霉毒素,操作簡(jiǎn)便,適于大批量樣品的分析。高效液相色譜法是目前國(guó)內(nèi)測(cè)定黃曲霉毒素使用最多、也是比較權(quán)威的方法,靈敏度高、精度高、能同時(shí)分析多種黃曲霉毒素類(lèi)型,但該法的樣品前處理相對(duì)復(fù)雜,檢測(cè)周期長(zhǎng)、程序復(fù)雜、所需試劑繁多、操作時(shí)需要專(zhuān)門(mén)的技術(shù)人員,難以滿(mǎn)足現(xiàn)代檢測(cè)。其中免疫親和色譜高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定飼料中黃曲霉素B1 ,采用甲醇水提取飼料中的黃曲霉素B1 ,用免疫親和色譜柱凈化,以甲醇和水為流動(dòng)相,反相高效液相色譜熒光檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)定,激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm ,發(fā)射波長(zhǎng)為435 nm。, % , %。此法適宜用于普通實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)食品中的黃曲霉素。物性天然毒素——河豚毒素的性質(zhì)與檢測(cè)方法河豚毒素的化學(xué)研究始于1909 年, 1964 年以后由Woodward 測(cè)定了TTX 的結(jié)構(gòu), 1972 年Kishi 等采用化學(xué)方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子式為C11H17N3O8, 。分子主要由3 個(gè)氮原子組成, 它們與氫氧原子形成特殊的結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)特征, 含有1 個(gè)碳環(huán), 1 個(gè)胍基, 6 個(gè)羥基, 在C—5 和C—10位有一個(gè)半醛糖內(nèi)酯連接著分開(kāi)的環(huán)。有專(zhuān)家將其稱(chēng)為“自然界最奇特的分子之一”, 也是世界上最致命的毒藥之一。1 g 河豚毒素的毒性是1 g 氰化物的1 萬(wàn)倍。TTX 粗制品為棕黃色粉末, 純品為無(wú)色晶體, 呈針狀或菱形, 無(wú)臭, 無(wú)味, 易吸濕潮解, 不溶于無(wú)水乙醇、乙醚、苯等有機(jī)溶劑, 微溶于水, 極易溶于稀酸水溶液。TTX 在溶液中存在TTX、半縮醛型TTX、內(nèi)酯型TTX動(dòng)態(tài)平衡的三種結(jié)構(gòu)。TTX 理化性質(zhì)比較穩(wěn)定, 在中性和酸性條件下對(duì)熱穩(wěn)定, 240℃開(kāi)始碳化, 但300 ℃以上也不分解。在堿水溶液中易分解, 在5%氫氧化鉀溶液中于80 ℃～100 ℃可分解成黃色結(jié)晶2氨基6羥甲基8羥基喹唑啉, 這也是TTX 化學(xué)檢測(cè)法的理論。河豚毒素的檢測(cè)方法主要有生物檢測(cè)法，儀器檢測(cè)法和免疫檢測(cè)法。以下主要介紹儀器檢測(cè)發(fā)。儀器檢測(cè)發(fā)有熒光光度法和色譜法熒光檢測(cè)法[9]是早期的檢測(cè)方法之一，主要是利用TTX 加堿水解后生成2氨基6羥甲基8羥基喹唑啉(簡(jiǎn)稱(chēng)C9 堿), 該物質(zhì)在特定波長(zhǎng)發(fā)熒光, 從而可進(jìn)行檢測(cè)。由于河豚毒素在紫外區(qū)間吸收很少, 使其紫外檢測(cè)受到限制, 所以紫外分光光度法采用TTX 在生成C9 堿的同時(shí)定量生成草酸鈉, 草酸鈉在紫外區(qū)有明顯吸收, 從而間接定量TTX。此法操作簡(jiǎn)便,但靈敏度低,專(zhuān)一性差。另外一種較常用的方法就是色譜法。有關(guān)高效液相色譜(HPLC)用于定量檢測(cè)TTX 的報(bào)道很多, 大多采用反相色譜, 用硅膠柱作固定相。張虹等建立了反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定河豚毒素含量的方法。選用SHIM ADZU ODS 色譜柱(1506 mm 5 μm), %(v/v)醋酸液為流動(dòng)相, mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。河豚毒素線性范圍20 μg/mL~100 μg/mL, r= 0(n=5): %, 最低檢測(cè)限50 ng。色譜法由于具有簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn), 再加上高靈敏度的檢測(cè)器成為眾多檢測(cè)方法中主要的方法, 但它要求檢測(cè)樣品的純度比較高。4細(xì)菌毒素———肉毒桿菌毒素和金黃色葡萄球菌腸毒素的性質(zhì)與檢測(cè)方法肉毒毒素(botulism neurotoxins,BoNTs)是肉毒梭菌產(chǎn)生的一種外毒素,屬于高分子量蛋白質(zhì)類(lèi)神經(jīng)毒素。根據(jù)肉毒毒素抗原不同,將其分為A～G 7個(gè)亞型。A型肉毒桿菌由毒性和非毒性蛋白兩部分組成,可高度特異地與突觸前膜結(jié)合,阻滯神經(jīng)興奮傳遞。BoNT/ ng/kg,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的生物毒素中毒性最強(qiáng)的物質(zhì)。在弱酸條件下, 150 kDa毒性亞基以非共價(jià)鍵方式與非毒性亞基結(jié)合成復(fù)合物以保持其生物活性。溫度40 ℃以上,尤其在堿性條件下,A型肉毒桿菌毒素迅速變性。黃金色葡萄球菌腸毒素(staphylococcus aureus enterotoxin, SE)是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的數(shù)種可引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)類(lèi)腸毒素,分子量約為26～30 kDa。根據(jù)血清學(xué)特征不同分為A～J 10個(gè)毒素血清型,其中A型毒力最強(qiáng)。腸毒素通過(guò)刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起中毒反應(yīng),小鼠LD50為25μg/kg。腸毒素易溶于水和鹽溶液,對(duì)熱穩(wěn)定, pH耐受范圍較寬(pH 4～10),不易被蛋白水解酶和消化酶降解。一株金葡菌產(chǎn)毒株能產(chǎn)生一種或兩種以上亞型的腸毒素,故腸毒素的型別不能代表細(xì)菌的型別。進(jìn)來(lái)常用的檢測(cè)方法有: 質(zhì)譜法,熒光分析法 ,免疫測(cè)定法，PCR檢測(cè)法（基于SYBR Green染料的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)技術(shù)）。以下介紹質(zhì)譜法和熒光分析法。Endopep2MS是基于肽鏈內(nèi)切酶的質(zhì)譜方法,可分辨肉毒毒素的不同亞型并測(cè)定其活性。該方法將抗體親和反應(yīng)與生物質(zhì)譜有機(jī)結(jié)合起來(lái), 血清樣品中的LOD 為: 肉毒毒素A: mouse LD50 /L,B: mouse LD50 /L, E: 2 1024 mouse LD50 /L, F: mouse LD50 /L。該方法與EL ISA相比靈敏度更高,且不易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。應(yīng)用LC2ESI2MS/MS檢測(cè)SEB不僅可以精確測(cè)定分子量,還可對(duì)SEB酶切后的肽段進(jìn)行氨基酸序列分析,近年來(lái)開(kāi)發(fā)的micro2ESI2TOF2MS具有更小的柱內(nèi)徑,對(duì)SEB的分析時(shí)間可顯著縮短至30 min,(水)。Anne等利用BoNT/B的蛋白水解酶活性實(shí)現(xiàn)對(duì)BoNT/B的檢測(cè),該方法以人突觸囊泡蛋白21的60～94部分的片段作為底物,用L 2芘基丙氨酸和熒光淬滅基團(tuán)(p2硝基苯丙氨酸)分別修飾74和77位點(diǎn)。肉毒毒素的活性鏈可選擇性地將突觸囊泡蛋白在76～77位點(diǎn)間切斷,去除77位點(diǎn)上修飾的熒光猝滅基團(tuán),再通過(guò)檢測(cè)60～76位點(diǎn)間發(fā)出的強(qiáng)熒光進(jìn)行直接定量檢測(cè)。 ng/L的肉毒毒素B。參考文獻(xiàn)Form中國(guó)學(xué)術(shù)期刊網(wǎng)：[1] 丁平，侯亞莉，程曉偉。高效液相色譜法測(cè)定飼料中黃曲霉素B1。飼料研究，2006，9：6163 【2】劉燕婷, 雷紅濤, 鐘青萍。河豚毒素的研究進(jìn)展。食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（2）：156159 [3] 周曉翠,謝光洪,劉國(guó)文,李妍,王帥玉,王照鵬,孔濤,宋文學(xué),2008,35(7): 4345 [4] 李書(shū)國(guó),陳輝,李雪梅,2009,17(2)。6265 [5] 暴銥,郭磊,陳佳,林纓,2009,37(5)。764771From SCI(Science Citation Index Expanded): [6] Neagu D, et of a toxinalkaline phosphatase conjugate forthe development of an immunosensor for tetrodotoxin Bioanal Chem,2006,