【文章內(nèi)容簡介】 acNeil IA,Tiong CL,Minor C,et al. Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries[J].J Mol Microbiol Biotechnol,20xx,3(2):301308. [17] Gill SR,Pop M,Deboy RT,et analysis of the human distal gut microbiome[J].Science,20xx,312(5778):13551359. [18] Breitbart M, Hewson I,Felts B,Mahaffy JM,Nulton J,Salamon P,Rohwer analyses of an uncultured viral munity from human feces[J].Bacteriol,20xx,185(20):6220 6223. [19] Walter J,Mangold M,Tannock ,analysis,and betaglucanase screening of a bacterial artificial chromosome library from thelargebowel microbiota of mice[J].Appl Environ ,71(5):23472354. [20] DiazTorres ML,Villedieu A,Hunt N,et the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approach[J].FEMS Microbiol Lett,20xx,258(2):257262. [21] Manichanh C,RigottierGois L,Bonnaud E,et diversity of faecal microbiota in Crohn39。s disease revealed by a metagenomic approach[J].Gut,20xx,55(2):205211. [22] Wenderoth DF,Ferslev B,Macarri G,et of microbial biofilm munities causing occlusion of biliary stents[J].Environ icrobiol,20xx,22:859866. [23]Mira A,Ochman H,Moran bias and the evolution of bacterial enome[J]. Trends Ge,20xx,17:589596. （二） 研究內(nèi)容、預(yù)期目標(biāo)、擬解決的主要問題 1 研究內(nèi)容 PCR 擴增細菌 16S rDNA 序列 16S rDNA序列 具有以下特點：（ 1）多拷貝： 16S rDNA編碼基因以多拷貝形式存在于所有細菌染色體基因組中，每個細菌約含 5～ 10個拷貝，這使得對該基因的檢測具有敏感性。（ 2）多信息： 16S rDNA編碼基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)由可變區(qū)和保守區(qū)組成。保守區(qū)為所有細菌所共有，細菌間無差別，有 “ 分子化石 ” 之稱?？勺儏^(qū)在不同細菌之間存在有不同程度的差異，具有屬或種的特異性，可變區(qū)與保守區(qū)交錯排列。可根據(jù)保守區(qū)設(shè)計各種細菌的通用引物，也可根據(jù)可變區(qū)設(shè)計特定細菌的特異引物或探針。 16S rDNA基因可變區(qū)所含信息的種間 差異使檢測具有特異性。（ 3）長度適中： 16S rDNA編碼基因長度適中，約 1500bp，不像 23S rDNA基因序列太長不易進行全序列測定，因此，各種細菌 16S rDNA基因的測序工作在微生物學(xué)界成為熱點。目前，人體液中常見病原菌的16S rDNA基因幾乎全部測序完成，為細菌的基因診斷提供了條件 ， 16S rDNA編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列，逐漸成為細菌鑒別、分類的金標(biāo)準(zhǔn)。 CSF 中細菌分類分析 使用 BLASTN 將序列比對到 16S rDNA 數(shù)據(jù)庫。挑選其中的最佳比對結(jié)果 。沒有比對上數(shù)據(jù)庫的序列不給出物種分類信息。 BLAST 有多個結(jié)果的序列會根據(jù)眾數(shù)原則，也就是如果 66%的比對結(jié)果都支持同一個物種分類，那么就認為是屬于那個物種分類的。如果不符合要求，就向上一個物種分類等級再做比對。 CSF 中物種豐度分析 首先，計算 tag 的豐度分布；然后， 為了更好地獲得樣品的細菌豐度，可基于 tag采用 OTU 分析的方法。 化膿性腦膜腦炎患者 CSF 中致病菌的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析 基于 16S rDNA V6 序列差異的大小，對一些類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 不同階段 樣品 間的比較分析 基于系統(tǒng)進化，功能注釋的多樣品比較分析可尋找 細菌 分類上的顯著差異。 2 研究目標(biāo) PCR 擴增細菌 16S rDNA 序列，為 細菌分類 及后續(xù)分析做準(zhǔn)備； 通過基因測序 ， 運用不同的分析方法和手段推測基因的種屬來源 、表達豐度、 建立 系統(tǒng)發(fā)生樹 并對 不同階段 樣品間的比較分析 尋找 細菌 變化的 顯著差異。 3 擬解決的關(guān)鍵問題 本研究運用 新一代高通量測序技術(shù) —— 16S rDNA 宏基因組測序技術(shù) ，對的 V6 可變區(qū)進行測序分析，不需進行克隆篩選，測序的 通量高，獲得的 數(shù)據(jù)量大，周期短，能更加全面的反映 樣本的物種組成、真實的物種分布及豐度信息。測序后 運 用 不同分析方法和手段進行生物信息學(xué)分析，可得到 物種分類、群落結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化、功能注釋等信息。所以測序和生物信息學(xué)分析是本研究的關(guān)鍵，本課題組將借助 深圳華大基因研究院生物信息中心 在基因組測序和生物信息學(xué)分析方面的強大優(yōu)勢來完成本課題的研究。 （三） 研究方法、技術(shù)路線、實驗（設(shè)計）方案及可行性分析 1 研究方法 選取 寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為化膿性腦膜腦炎患者 1~2 例 ，對此患者進行動態(tài)觀察，分別收集入院時 、 治療 3 天 、 7 天 、 12 天 時 的 CSF 標(biāo)本 ， 應(yīng)用 通 用引物擴增細菌 16S rDNA 序列， 采用 16S rDNA 宏基因組測序技術(shù) 對樣品 16S rDNA 的 V6可變區(qū)進行測序，并拼接成 Tag，并根據(jù) Tag 進行物種分類、 OTU 分析、多樣性分析、比較分析等 可得到化膿性腦膜炎患者 CSF 中菌 群的物種分類、物種豐度、系統(tǒng)進化、功能注釋等信息。 2 技術(shù)路線 圖 3 實驗方案 樣本采集 擬收集寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 20xx 年 5 月至 20xx 年 8 月 確診 化膿性腦膜腦炎患者1 例 ，分別取此患者入院時 、 治療 3 天 、 7 天 、 12 天 時 CSF 各 1~2ml； 化膿性腦膜腦炎的臨床診 斷標(biāo)準(zhǔn)： （ 1）有或無近期呼吸道或腸道感染史，有或無中耳炎、鼻竇炎等病史； （ 2）有發(fā)熱、頭痛、嘔吐、抽搐等癥狀，有嗜睡、譫妄或昏迷等意識障礙； （ 3）體格檢查：頸項強直、 Kernig征及 Brudzinski征陽性，但成人患者陽性率僅 50％，故對陰性者不能排除診斷；視乳頭水腫，腦神經(jīng)麻痹； （ 4）輔助檢查 ① 血常規(guī)：白細胞計數(shù)明顯增多，可達 (20～ 40) 109／ L，中性粒細胞達 90％以上； ② CSF檢查： CSF壓力 200mmH2O，外觀混濁或呈膿性，糖 ，氯化物120mmol/L，蛋 白質(zhì) ，未經(jīng)治療的化膿性腦膜腦炎白細胞數(shù)高于正常水平，為(1000～ 10000) 106／ L，以中性粒細胞升高最為明顯；但亦有 10％患者以淋巴細胞升高為主。 CSF涂片鏡檢及細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)病原菌為診斷金標(biāo)準(zhǔn)； ③ 血細菌培養(yǎng)：血培養(yǎng)陽性具有確定病原的價值； ④ 腦 CT早期正常，病程進展可見腦膜呈線狀強化，硬膜下積液可見顱骨內(nèi)板下新月形低密度區(qū)，包膜形成時可見內(nèi)膜強化，室管膜炎及脈絡(luò)膜炎時腦室壁呈線狀強化，腦積水顯示腦室擴大，腦實質(zhì)受損可見低密度區(qū)和占位效應(yīng)； ⑤ 腦 MRI早期腦膜及皮質(zhì)呈條狀信號增強，腦組織廣泛水腫，腦溝和腦裂變??；中期皮質(zhì)和皮質(zhì)下梗死， T1WI低信號， T2WI高信號；后期可見腦積水、硬膜下積液及腦萎縮等； 排除以下疾?。猴B腦外傷、腦腫瘤、 顱內(nèi)出血、其它致病微生物所致顱內(nèi)感染、腦白質(zhì)病變、代謝性腦病等 。 樣本的處理 從 80℃ 冰箱取出 CSF樣本，室溫解凍 ， 分別將每份 CSF混勻后， 于 Effendorf管中，采用差速離心法對樣本中的細菌進行富集。 提取 CSF 總 DNA 應(yīng)用 IsoQuick 試劑盒提取樣本中的總 DNA，按照試劑 盒操作說明進行。 DNA片段大小、濃度、純度測算 樣品 DNA 濃度以及大小的測算是用已知濃度的 Marker 作為對照和樣品 DNA同時電泳根據(jù) DNA條帶亮度推算出 DNA的大概濃度，根據(jù) DNA條帶位置推 算出 DNA的大概片段長度，樣品 DNA純度估計是將 2μ l DNA樣品稀釋至 500μ l后測定260nm和 280nm下樣品的 OD值，通過樣品 OD260/OD280 的值來進行估計的。OD260/OD280 在 ，小于 DNA或RNA，大于 品中含有較多的蛋白。 16S rDNA 引物的選取與 PCR 擴增 本研究選擇 16S rDNA 基因通用引物： 27F(5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’ )和 1492R(5’ TACTTGTTACGACTT3’ )，進行 PCR 擴增。反應(yīng)產(chǎn)物保存于 4 ℃ 備用。 測序與生物信息學(xué)分析 將 PCR擴增產(chǎn)物送去測序（本部分 在 深圳華大基因信息研究院生物信息中心完成）。 采用與新一代高通量測序技術(shù)相結(jié)合的 16S rDNA Metagenomes 測序技術(shù)，對樣品 16S rDNA 的 V6 可變區(qū)的 PCR 產(chǎn)物進行測序，并拼接成 Tag，并根據(jù) Tag 進行 細菌 分類、OTU 分析、多樣性分析、比較分析等。 測序 及分析 流程： （ 1）進行原始數(shù)據(jù)的處理： ① 去除有 adapter 污染的序列 ； ② 數(shù)據(jù)的拼接：運用華大研發(fā)的 overlap 拼接軟件對數(shù)據(jù)進行拼接，得到拼接的結(jié)果。通過重疊關(guān)系將兩條兩端測序得到的序列組裝成一條序列。拼接的條件是最小匹配長度為 5bp，重疊區(qū)域不允許錯配， N 所占最大百分比是 。為了更多的利用序列，不滿足以上結(jié)果的序列將各切除 5bp 繼續(xù)組裝，如此重復(fù)多次。最終產(chǎn)生的就是 V6 區(qū)的序列 。 ③ 去除引物：挑出完全匹配引物的序列，而不匹配的序列不進行后續(xù)分析，去除 V6 區(qū)兩端的引物。去除引物后剩下的序列稱為 tag。 （ 2） 細菌 復(fù)雜度分析：計算 tag 的豐度分布。