【文章內(nèi)容簡介】 acNeil IA,Tiong CL,Minor C,et al. Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries[J].J Mol Microbiol Biotechnol,20xx,3(2):301308. [17] Gill SR,Pop M,Deboy RT,et analysis of the human distal gut microbiome[J].Science,20xx,312(5778):13551359. [18] Breitbart M, Hewson I,Felts B,Mahaffy JM,Nulton J,Salamon P,Rohwer analyses of an uncultured viral munity from human feces[J].Bacteriol,20xx,185(20):6220 6223. [19] Walter J,Mangold M,Tannock ,analysis,and betaglucanase screening of a bacterial artificial chromosome library from thelargebowel microbiota of mice[J].Appl Environ ,71(5):23472354. [20] DiazTorres ML,Villedieu A,Hunt N,et the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approach[J].FEMS Microbiol Lett,20xx,258(2):257262. [21] Manichanh C,RigottierGois L,Bonnaud E,et diversity of faecal microbiota in Crohn39。s disease revealed by a metagenomic approach[J].Gut,20xx,55(2):205211. [22] Wenderoth DF,Ferslev B,Macarri G,et of microbial biofilm munities causing occlusion of biliary stents[J].Environ icrobiol,20xx,22:859866. [23]Mira A,Ochman H,Moran bias and the evolution of bacterial enome[J]. Trends Ge,20xx,17:589596. （二） 研究內(nèi)容、預(yù)期目標(biāo)、擬解決的主要問題 1 研究內(nèi)容 PCR 擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA 序列 16S rDNA序列 具有以下特點(diǎn)：（ 1）多拷貝： 16S rDNA編碼基因以多拷貝形式存在于所有細(xì)菌染色體基因組中，每個(gè)細(xì)菌約含 5～ 10個(gè)拷貝，這使得對(duì)該基因的檢測(cè)具有敏感性。（ 2）多信息： 16S rDNA編碼基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)由可變區(qū)和保守區(qū)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌所共有，細(xì)菌間無差別，有 “ 分子化石 ” 之稱?？勺儏^(qū)在不同細(xì)菌之間存在有不同程度的差異，具有屬或種的特異性，可變區(qū)與保守區(qū)交錯(cuò)排列?？筛鶕?jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)各種細(xì)菌的通用引物，也可根據(jù)可變區(qū)設(shè)計(jì)特定細(xì)菌的特異引物或探針。 16S rDNA基因可變區(qū)所含信息的種間 差異使檢測(cè)具有特異性。（ 3）長度適中： 16S rDNA編碼基因長度適中，約 1500bp，不像 23S rDNA基因序列太長不易進(jìn)行全序列測(cè)定，因此，各種細(xì)菌 16S rDNA基因的測(cè)序工作在微生物學(xué)界成為熱點(diǎn)。目前，人體液中常見病原菌的16S rDNA基因幾乎全部測(cè)序完成，為細(xì)菌的基因診斷提供了條件 ， 16S rDNA編碼基因的這些特點(diǎn)使之成為較理想的細(xì)菌基因分類的靶序列，逐漸成為細(xì)菌鑒別、分類的金標(biāo)準(zhǔn)。 CSF 中細(xì)菌分類分析 使用 BLASTN 將序列比對(duì)到 16S rDNA 數(shù)據(jù)庫。挑選其中的最佳比對(duì)結(jié)果 。沒有比對(duì)上數(shù)據(jù)庫的序列不給出物種分類信息。 BLAST 有多個(gè)結(jié)果的序列會(huì)根據(jù)眾數(shù)原則，也就是如果 66%的比對(duì)結(jié)果都支持同一個(gè)物種分類，那么就認(rèn)為是屬于那個(gè)物種分類的。如果不符合要求，就向上一個(gè)物種分類等級(jí)再做比對(duì)。 CSF 中物種豐度分析 首先，計(jì)算 tag 的豐度分布；然后， 為了更好地獲得樣品的細(xì)菌豐度，可基于 tag采用 OTU 分析的方法。 化膿性腦膜腦炎患者 CSF 中致病菌的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析 基于 16S rDNA V6 序列差異的大小，對(duì)一些類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 不同階段 樣品 間的比較分析 基于系統(tǒng)進(jìn)化，功能注釋的多樣品比較分析可尋找 細(xì)菌 分類上的顯著差異。 2 研究目標(biāo) PCR 擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA 序列，為 細(xì)菌分類 及后續(xù)分析做準(zhǔn)備； 通過基因測(cè)序 ， 運(yùn)用不同的分析方法和手段推測(cè)基因的種屬來源 、表達(dá)豐度、 建立 系統(tǒng)發(fā)生樹 并對(duì) 不同階段 樣品間的比較分析 尋找 細(xì)菌 變化的 顯著差異。 3 擬解決的關(guān)鍵問題 本研究運(yùn)用 新一代高通量測(cè)序技術(shù) —— 16S rDNA 宏基因組測(cè)序技術(shù) ，對(duì)的 V6 可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，不需進(jìn)行克隆篩選，測(cè)序的 通量高，獲得的 數(shù)據(jù)量大，周期短，能更加全面的反映 樣本的物種組成、真實(shí)的物種分布及豐度信息。測(cè)序后 運(yùn) 用 不同分析方法和手段進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可得到 物種分類、群落結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、功能注釋等信息。所以測(cè)序和生物信息學(xué)分析是本研究的關(guān)鍵，本課題組將借助 深圳華大基因研究院生物信息中心 在基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析方面的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)來完成本課題的研究。 （三） 研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)（設(shè)計(jì)）方案及可行性分析 1 研究方法 選取 寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為化膿性腦膜腦炎患者 1~2 例 ，對(duì)此患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，分別收集入院時(shí) 、 治療 3 天 、 7 天 、 12 天 時(shí) 的 CSF 標(biāo)本 ， 應(yīng)用 通 用引物擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA 序列， 采用 16S rDNA 宏基因組測(cè)序技術(shù) 對(duì)樣品 16S rDNA 的 V6可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，并拼接成 Tag，并根據(jù) Tag 進(jìn)行物種分類、 OTU 分析、多樣性分析、比較分析等 可得到化膿性腦膜炎患者 CSF 中菌 群的物種分類、物種豐度、系統(tǒng)進(jìn)化、功能注釋等信息。 2 技術(shù)路線 圖 3 實(shí)驗(yàn)方案 樣本采集 擬收集寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 20xx 年 5 月至 20xx 年 8 月 確診 化膿性腦膜腦炎患者1 例 ，分別取此患者入院時(shí) 、 治療 3 天 、 7 天 、 12 天 時(shí) CSF 各 1~2ml； 化膿性腦膜腦炎的臨床診 斷標(biāo)準(zhǔn)： （ 1）有或無近期呼吸道或腸道感染史，有或無中耳炎、鼻竇炎等病史； （ 2）有發(fā)熱、頭痛、嘔吐、抽搐等癥狀，有嗜睡、譫妄或昏迷等意識(shí)障礙； （ 3）體格檢查：頸項(xiàng)強(qiáng)直、 Kernig征及 Brudzinski征陽性，但成人患者陽性率僅 50％，故對(duì)陰性者不能排除診斷；視乳頭水腫，腦神經(jīng)麻痹； （ 4）輔助檢查 ① 血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多，可達(dá) (20～ 40) 109／ L，中性粒細(xì)胞達(dá) 90％以上； ② CSF檢查： CSF壓力 200mmH2O，外觀混濁或呈膿性，糖 ，氯化物120mmol/L，蛋 白質(zhì) ，未經(jīng)治療的化膿性腦膜腦炎白細(xì)胞數(shù)高于正常水平，為(1000～ 10000) 106／ L，以中性粒細(xì)胞升高最為明顯；但亦有 10％患者以淋巴細(xì)胞升高為主。 CSF涂片鏡檢及細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)病原菌為診斷金標(biāo)準(zhǔn)； ③ 血細(xì)菌培養(yǎng)：血培養(yǎng)陽性具有確定病原的價(jià)值； ④ 腦 CT早期正常，病程進(jìn)展可見腦膜呈線狀強(qiáng)化，硬膜下積液可見顱骨內(nèi)板下新月形低密度區(qū)，包膜形成時(shí)可見內(nèi)膜強(qiáng)化，室管膜炎及脈絡(luò)膜炎時(shí)腦室壁呈線狀強(qiáng)化，腦積水顯示腦室擴(kuò)大，腦實(shí)質(zhì)受損可見低密度區(qū)和占位效應(yīng)； ⑤ 腦 MRI早期腦膜及皮質(zhì)呈條狀信號(hào)增強(qiáng)，腦組織廣泛水腫，腦溝和腦裂變??；中期皮質(zhì)和皮質(zhì)下梗死， T1WI低信號(hào)， T2WI高信號(hào)；后期可見腦積水、硬膜下積液及腦萎縮等； 排除以下疾?。猴B腦外傷、腦腫瘤、 顱內(nèi)出血、其它致病微生物所致顱內(nèi)感染、腦白質(zhì)病變、代謝性腦病等 。 樣本的處理 從 80℃ 冰箱取出 CSF樣本，室溫解凍 ， 分別將每份 CSF混勻后， 于 Effendorf管中，采用差速離心法對(duì)樣本中的細(xì)菌進(jìn)行富集。 提取 CSF 總 DNA 應(yīng)用 IsoQuick 試劑盒提取樣本中的總 DNA，按照試劑 盒操作說明進(jìn)行。 DNA片段大小、濃度、純度測(cè)算 樣品 DNA 濃度以及大小的測(cè)算是用已知濃度的 Marker 作為對(duì)照和樣品 DNA同時(shí)電泳根據(jù) DNA條帶亮度推算出 DNA的大概濃度，根據(jù) DNA條帶位置推 算出 DNA的大概片段長度，樣品 DNA純度估計(jì)是將 2μ l DNA樣品稀釋至 500μ l后測(cè)定260nm和 280nm下樣品的 OD值，通過樣品 OD260/OD280 的值來進(jìn)行估計(jì)的。OD260/OD280 在 ，小于 DNA或RNA，大于 品中含有較多的蛋白。 16S rDNA 引物的選取與 PCR 擴(kuò)增 本研究選擇 16S rDNA 基因通用引物： 27F(5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’ )和 1492R(5’ TACTTGTTACGACTT3’ )，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物保存于 4 ℃ 備用。 測(cè)序與生物信息學(xué)分析 將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序（本部分 在 深圳華大基因信息研究院生物信息中心完成）。 采用與新一代高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的 16S rDNA Metagenomes 測(cè)序技術(shù)，對(duì)樣品 16S rDNA 的 V6 可變區(qū)的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并拼接成 Tag，并根據(jù) Tag 進(jìn)行 細(xì)菌 分類、OTU 分析、多樣性分析、比較分析等。 測(cè)序 及分析 流程： （ 1）進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的處理： ① 去除有 adapter 污染的序列 ； ② 數(shù)據(jù)的拼接：運(yùn)用華大研發(fā)的 overlap 拼接軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，得到拼接的結(jié)果。通過重疊關(guān)系將兩條兩端測(cè)序得到的序列組裝成一條序列。拼接的條件是最小匹配長度為 5bp，重疊區(qū)域不允許錯(cuò)配， N 所占最大百分比是 。為了更多的利用序列，不滿足以上結(jié)果的序列將各切除 5bp 繼續(xù)組裝，如此重復(fù)多次。最終產(chǎn)生的就是 V6 區(qū)的序列 。 ③ 去除引物：挑出完全匹配引物的序列，而不匹配的序列不進(jìn)行后續(xù)分析，去除 V6 區(qū)兩端的引物。去除引物后剩下的序列稱為 tag。 （ 2） 細(xì)菌 復(fù)雜度分析：計(jì)算 tag 的豐度分布。