【文章內(nèi)容簡介】 定期更換培養(yǎng)液，防止代謝產(chǎn)物積累對細胞自身造成危害。②營養(yǎng)：合成培養(yǎng)基成分：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。通常需加入血清、血漿等天然成分。③溫度：適宜溫度：℃＋℃；pH：～。④氣體環(huán)境：95%空氣＋5%CO2。O2是細胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。（5）動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測有毒物質(zhì)、培養(yǎng)醫(yī)學研究的各種細胞。（1）哺乳動物核移植可以分為胚胎細胞核移植（比較容易）和體細胞核移植（比較難）。（2）選用去核卵(母)細胞的原因：卵(母)細胞比較大，容易操作；卵(母)細胞細胞質(zhì)多，營養(yǎng)豐富。（3）體細胞核移植的大致過程是：高產(chǎn)奶牛（提供體細胞）進行細胞培養(yǎng)；同時采集卵母細胞，在體外培養(yǎng)到減二分裂中期的卵母細胞，去核（顯微操作）[注：為什么要用卵細胞？它可以提供充足的營養(yǎng)；操作簡便；細胞質(zhì)不會抑制細胞核全能性的表達]；將供體細胞注入去核卵母細胞；通過電刺激使兩細胞融合，供體核進入受體卵母細胞，構(gòu)建重組胚胎；將胚胎移入受體（代孕）母牛體內(nèi)；生出與供體奶牛遺傳基因相同的犢牛（4）體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用：①加速家畜遺傳改良進程，促進良畜群繁育；②保護瀕危物種，增大存活數(shù)量； ③生產(chǎn)珍貴的醫(yī)用蛋白；④作為異種移植的供體；⑤用于組織器官的移植等。（5）體細胞核移植技術(shù)存在的問題：克隆動物存在著健康問題、表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷等。（1）動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞。（2）動物細胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同，誘導(dǎo)動物細胞融合的方法與植物原生質(zhì)體融合的方法類似，常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。（3）動物細胞融合的意義：克服了遠緣雜交的不親和性，成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物生物新品種培育的重要手段。（4）動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較：（1）抗體：一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差。（2）單克隆抗體的制備過程：對免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠產(chǎn)生了效應(yīng)B細胞）；提取B淋巴細胞；同時用動物細胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)骨髓瘤細胞并提??；促使它們細胞融合[注：融合的結(jié)果是有很多不符合要求的；如有2個B淋巴細胞融合的細胞等，所以要進行篩選]；在特定的選擇培養(yǎng)基上篩選出融合的雜種細胞[特點是能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一的抗體]；然后對它進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測[篩選出能夠分泌所需抗體的雜種細胞]；最后將雜交瘤細胞在體外做大規(guī)模培養(yǎng)或注射入小鼠腹腔內(nèi)增殖，從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中可得到大量的單克隆抗體。（3）雜交瘤細胞的特點：既能大量繁殖，又能產(chǎn)生專一的抗體。（4）單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，并能大量制備。（5）單克隆抗體的作用：作為診斷試劑：準確識別各種抗原物質(zhì)的細微差異，并跟一定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，具有準確、高效、簡易、快速的優(yōu)點。用于治療疾病和運載藥物：主要用于治療癌癥治療，可制成“生物導(dǎo)彈”，也有少量用于治療其它疾病。三、胚胎工程（一）動物胚胎發(fā)育的基本過程（1）精子的發(fā)生：補充，精原細胞先進行有絲分裂后進行減數(shù)分裂；變形過程中，細胞核為精子頭的主要部分，高爾基體發(fā)育為頂體，中心體演變?yōu)榫拥奈?，線粒體在尾基部形成線粒體鞘膜，其他物質(zhì)濃縮為原生質(zhì)滴直至脫落。[線粒體為精子運動提供能量]（2）卵子的發(fā)生：在胎兒時期，卵原細胞進行有絲分裂演變成初級卵母細胞[被卵泡細胞包圍]，減一分裂在排卵前后完成，形成次級卵母細胞和第一極體進入輸卵管準備受精；減二分裂是在受精過程中完成的。（3）受精：精子獲能（在雌性動物生殖道內(nèi)）；卵子的準備（排出的卵子要在輸卵管中進一步成熟到減二中期才具備受精能力）；受精階段[卵子周圍的結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)：放射冠、透明帶、卵黃膜]，a頂體反應(yīng)：精子釋放頂體酶溶解卵丘細胞之間的物質(zhì)，穿越放射冠。b透明帶反應(yīng)：頂體酶可將透明帶溶出孔道，精子穿入，在精子觸及卵黃膜的瞬間阻止后來精子進入透明帶的生理反應(yīng)[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障]；c卵黃膜的封閉作用：精子外膜和卵黃膜融合，精子入卵后，卵黃膜會拒絕其他精子再進入卵內(nèi)的過程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障]；精子尾部脫落，原有核膜破裂形成雄原核，同時卵子完成減二分裂，形成雌原核[注意：受精標志是第二極體的形成；受精完成標志是雌雄原核融合成合子]。（4）胚胎發(fā)育：a卵裂期：細胞進行有絲分裂，數(shù)量增加，胚胎總體積不增加；b桑椹胚：32個細胞左右的胚胎[之前所有細胞都能發(fā)育成完整胚胎的潛能屬全能細胞]；c囊胚：細胞開始分化，其中個體較大的細胞叫內(nèi)細胞團將來發(fā)育成胎兒的各種組織；而滋養(yǎng)層細胞將來發(fā)育成胎膜和胎盤；胚胎內(nèi)部逐漸出現(xiàn)囊胚腔[注：囊胚的擴大會導(dǎo)致透明帶的破裂，胚胎伸展出來，這一過程叫孵化]；d原腸胚：內(nèi)細胞團表層形成外胚層，下方細胞形成內(nèi)胚層，由內(nèi)胚層包圍的囊腔叫原腸腔。[細胞分化在胚胎期達到最大限度] 9 胚胎工程的理論基礎(chǔ)（識記）（1）胚胎工程的概念及技術(shù)手段：對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術(shù)，如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養(yǎng)等技術(shù)。（2）體外受精[屬有性生殖過程]：a卵母細胞的采集和培養(yǎng) 對體型小的動物用促性腺激素處理，從輸卵管沖取卵子（可直接受精）；對體型大的動物從卵巢中采集卵母細胞（要在體外培養(yǎng)成熟）b精子的采集 假陰道法、手握法和電刺激法；獲能 對嚙齒動物、兔、豬等的精子用培養(yǎng)法（放入人工配制的獲能液中）；對牛、羊等精子用化學法（放在肝素或鈣離子載體溶液中）（3）胚胎的早期培養(yǎng)：a培養(yǎng)液成分：無機鹽、有機鹽、維生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等[注意與動物細胞培養(yǎng)液成分的比較]；b當胚胎發(fā)育到適宜的階段時，可將其取出向受體移植或冷凍保存。（4）胚胎移植：a概念：將雌性動物的早期胚胎移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動物的體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。是生產(chǎn)胚胎的供體和孕育胚胎的受體共同繁殖后代的過程，通過轉(zhuǎn)基因、核移植、體外受精獲得的胚胎必須移植給受體才能獲得后代。b優(yōu)勢：可以充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁殖潛力，縮短供體本身的繁殖周期。c胚胎移植的生理學基礎(chǔ)：同種動物的供、受體生殖器官的生理變化是相同的[對供體和受體進行同期發(fā)情處理]；早期胚胎形成后處于游離狀態(tài)，為胚胎的收集提供可能；受體對移入子宮的外來胚胎基本不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；移入受體的供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受影響。d胚胎移植的程序：對供、受體母牛進行選擇，用激素進行同期發(fā)情處理；對供體母牛用激素做超數(shù)排卵處理；選擇同種優(yōu)秀公牛配種[有性生殖過程]；對胚胎進行收集[此時胚胎處于游離狀態(tài)]；對胚胎進行質(zhì)量檢查[此時胚胎應(yīng)發(fā)育到桑椹胚或囊胚]；胚胎移植[或冷凍保存]；檢查受體母牛是否受孕；產(chǎn)下胚胎移植的犢牛。（5）胚胎分割：a概念：用機械方法將早期胚胎切割成8等分等，經(jīng)移植獲得同卵雙胎或多胎的技術(shù)[可看作是動物無性繁殖或克隆] b基本過程：選擇良好的桑椹胚或囊胚移入培養(yǎng)皿中，用分割針或分割刀片將其切開，吸出其中的半個胚胎注入透明帶中或直接移植給受體。[注意：內(nèi)細胞團要均等分割，否則會影響胚胎的恢復(fù)和進一步發(fā)育] 10 胚胎干細胞的移植（識記）（1）胚胎干細胞的含義：由早期胚胎[囊胚]或原始性腺[胎兒]中分離出來的一類細胞，又叫ES或EK細胞。（2）特征：形態(tài)上體積小、細胞核大、核仁明顯；功能上具有發(fā)育的全能性，即可分化為成年動物體內(nèi)任何一種組織細胞。[體外培養(yǎng)下，ES細胞可以只增殖不分化]（3）應(yīng)用：用于治療人類疾病，如利用ES細胞誘導(dǎo)其分化成新的組織細胞特性，移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)。胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術(shù)，如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養(yǎng)等技術(shù)。經(jīng)過處理后獲得的胚胎，還需移植到雌性動物體內(nèi)生產(chǎn)后代，以滿足人類的各種需求。動物胚胎發(fā)育的基本過程（1）受精場所是母體的輸卵管。（2）卵裂期：特點：細胞有絲分裂，細胞數(shù)量不斷增加，但胚胎的總體體積并不增加，或略有減小。（3）桑椹胚：特點：胚胎細胞數(shù)目達到32個左右時，胚胎形成致密的細胞團，形似桑椹。是全能細胞。（4）囊 胚：特點：細胞開始出現(xiàn)分化（該時期細胞的全能性仍比較高）。聚集在胚胎一端個體較大的細胞稱為內(nèi)細胞團，將來發(fā)育成胎兒的各種組織。中間的空腔稱為囊胚腔。（5）原腸胚：特點：有了三胚層的分化，具有囊胚腔和原腸腔。（二）胚胎干細胞哺乳動物的胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或從原始性腺中分離出來。具有胚胎細胞的特性，在形態(tài)上表現(xiàn)為體積小，細胞核大，核仁明顯；在功能上，具有發(fā)育的全能性，可分化為成年動物體內(nèi)任何一種組織細胞。另外，在體外培養(yǎng)的條件下，可以增殖而不發(fā)生分化，可進行冷凍保存，也可進行遺傳改造。胚胎干細胞的主要用途是：①可用于研究哺乳動物個體發(fā)生和發(fā)育規(guī)律；②是在體外條件下研究細胞分化的理想材料，在培養(yǎng)液中加入分化誘導(dǎo)因子，如牛黃酸等化學物質(zhì)時，就可以誘導(dǎo)ES細胞向不同類型的組織細胞分化，這為揭示細胞分化和細胞凋亡的機理提供了有效的手段；③可以用于治療人類的某些頑疾，如帕金森綜合癥、少年糖尿病等；④利用可以被誘導(dǎo)分化形成新的組織細胞的特性，移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能；⑤隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過ES細胞體外誘導(dǎo)分化，定向培育出人造組織器官，用于器官移植，解決供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題。（三）胚胎工程的應(yīng)用 (1)卵母細胞的采集和培養(yǎng)：主要方法：用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然后，從輸卵管中沖取卵子，直接與獲能的精子在體外受精。第二種方法：從剛屠宰母畜的卵巢中采集卵母細胞；第三種方法是借助超聲波探測儀、腹腔鏡等直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。采集的卵母細胞，都要在體外經(jīng)人工培養(yǎng)成熟后，才能與獲能的精子受精。(2)精子的采集和獲能：在體外受精前，要對精子進行獲能處理。(3)受精：獲能的精子和培養(yǎng)成熟的卵細胞在獲能溶液或?qū)Ｓ玫氖芫芤褐型瓿墒芫^程。(4)胚胎的早期培養(yǎng)：精子與卵子在體外受精后，應(yīng)將受精卵移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育能力。培養(yǎng)液成分較復(fù)雜，除一些無