【文章內(nèi)容簡介】 培養(yǎng)基種類特點 發(fā)酵工藝中 ,按菌種生長環(huán)境順序，培養(yǎng)基有 : A:孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨。 B:米孢子培養(yǎng)基： 優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基。 C:一級種子發(fā)酵罐：葡萄糖、玉米漿、碳酸鈣、玉米油、消泡劑等。 D:二級種子發(fā)酵罐：玉米漿、蛋白質(zhì)等。 菌種生長 產(chǎn)青霉菌的菌種在發(fā)酵條件下，深層培養(yǎng)，經(jīng)歷了 7 個不同時期，每個時期有其菌體形態(tài)特征。在規(guī)定時間取樣，通過顯微鏡檢查（生產(chǎn)上習(xí)慣稱為鏡檢）這些形態(tài)變化，用于過程控制。 第一期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。 第二期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。 第三期：形成脂肪包涵體，累積儲藏物，沒有空泡，嗜堿性強。 第四期：脂 肪包涵體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。 第五期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲成桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。 第六期：出現(xiàn)個別自溶細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀，釋放游離氨，PH 上升。 第七期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。 1~4 期為菌絲生長期， 3 期的菌體適宜為種子。 4~5 期為生產(chǎn)期生產(chǎn)能力最強，通過工藝措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。 主要設(shè)備工藝流程框圖 在工藝路線和生產(chǎn)方法確定之后，物料衡算開始之前表示生產(chǎn)工藝過程的一種定性圖 紙 ,詳見附 圖 。 3 工藝控制及要點 工藝控制 影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素 基質(zhì)濃度在分批發(fā)酵中，常常因為前期基質(zhì)量濃度過高，對生物合成酶系產(chǎn)生阻遏（或抑制）或?qū)z生長產(chǎn)生抑制（如葡萄糖和錢的阻遏或抑制 ,苯乙酸的生長抑制） ,而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成 ,為了避免這一現(xiàn)象 ,在青霉素發(fā)酵中通常采用補料分批操作法 ,即對容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)進行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加 ,因為即使是超出最適濃度范圍較小的波動 ,都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制 ,使生物合成速度減慢或停止。目前 ,糖濃度的檢測尚難在線進行 ,故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制 ,而是間接根據(jù) pH 值、溶氧或 C02 釋放率予以調(diào)節(jié)。 溫度 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別 ,但一般認(rèn)為應(yīng)在 25 176。C 左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率 ,同時增加葡萄糖的維持消耗 ,降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對菌絲生長和青霉素合成來說 ,最適溫度不是一樣的 ,一般前者略高于后者 ,故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用年產(chǎn) 1 萬噸青霉素原料藥工廠發(fā)酵車間的設(shè)計 6 較高的溫度，以縮短生長時間 ,到達生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 ,以利于青霉素的合成。 pH 值 青霉素發(fā)酵的最適 pH 值一般認(rèn)為在 左右 ,有時也可以略高或略低一些 ,但應(yīng)盡量避免 pH 值超過 ,因為青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定 ,容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中 ,pH 值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。過高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積累使 pH 值降低 。過低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起 pH 值上升。 溶解氧 對于好氧的青霉素發(fā)酵來說 ,溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重要因素。當(dāng)溶氧濃度降 30%飽和度以下時 ,青霉 素產(chǎn)率急劇下降 ,低于 10%飽和度時 ,則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高 ,說明菌絲生長不良或加糖率過低 ,造成呼吸強度下降 ,同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個動態(tài)平衡點 ,而氧消耗與碳能源消耗成正比 ,故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個參考指標(biāo)。 消沫 發(fā)酵過程泡沫較多，需要加入消沫劑，天然油脂如玉米油，化學(xué)消沫劑如泡敵。少量多次，不適在前期多加入 ，影響呼吸代謝。 菌絲濃度 發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度 ,從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某 一溶氧水平上達到平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強度 (取決于維持因數(shù)的大小 ,維持因數(shù)越大 ,呼吸強度越高 )、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強度低的菌株降低發(fā)酵中氧的消耗速率，而通氣與攪拌能力強的發(fā)酵罐及黏度低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升 ,從而提高臨界菌體濃度。 菌絲生長速度 用恒化器進行的發(fā)酵試驗證明，在葡萄糖限制生長的條件下，青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長速率之間呈現(xiàn)一定的關(guān)系。當(dāng)比生長速 率低于 的時候，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比 ,當(dāng)比生 長速率高于 ,比生產(chǎn)速率與比生長速率無關(guān) D 因此 ,要在發(fā)酵過程中達到并維持最大比生產(chǎn)速率 ,必須使比生長速率不低 。這一比生長速率稱為臨界比生長速率。對于分批補料發(fā)酵的生產(chǎn)階段來說 ,維持 的臨界比生長速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍 ,這在實際工業(yè)生產(chǎn)中是很難實現(xiàn)的。事實上 ,青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多 ,卻仍然能達到很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補料分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶 ,抵消了一部分生長 ,故雖然表觀比生 長速率低 ,但真比生長速率卻要高一些。 菌絲形態(tài) 在長期的菌株改良中 ,青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸 ,故一般比生產(chǎn)速率較高；后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低 ,使氣 液兩相間氧的傳遞速率大大提高 ,從而允許更多的菌絲生長 (即臨界菌體濃度較高 ),發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。 在絲狀菌發(fā)酵中 , 控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L度 ,并避免結(jié)球 ,是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中 ,使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊 ,并盡量減少游離菌絲的含量 ,也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強度及比生長速率密切相關(guān)。 工藝控制要點 種子質(zhì)量的控制 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上， 25176。C 培養(yǎng) 7 天 ,真空干燥并以這種形式保存?zhèn)溆谩Ｉa(chǎn)時它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內(nèi) ,26 176。C 培養(yǎng) 56h 左右 ,菌絲濃度達 6%8%,菌絲形態(tài)正常 ,按10%15%的接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖 為主的二級種子罐內(nèi) ,27176。C 培養(yǎng) 24h,菌絲體積 10%12%,形態(tài)正常 ,效價在 700D/ml 左右便可作為發(fā)酵種子。 球狀菌的生產(chǎn)種子是由冷凍管子孢子經(jīng)混有 %%玉米漿的三角瓶培養(yǎng)原始親米孢子 ,然后再移人羅氏瓶培養(yǎng)生產(chǎn)大米抱子 (又稱生產(chǎn)米 ),親米和生產(chǎn)米均為 25176。C 靜置培養(yǎng) ,需經(jīng)常觀察生長發(fā)育情況在培養(yǎng)到 34天 ,大米表面長出明顯小集落時要振搖均勻 ,使菌絲在大米表面能均勻生長 ,年產(chǎn) 1 萬噸青霉素原料藥工廠發(fā)酵車間的設(shè)計 8 待 10 天左右形成綠色孢子即可收獲。親米成熟接人生產(chǎn)米后也要經(jīng)過激烈振蕩才可放置恒溫培養(yǎng) ,生產(chǎn)米的孢子量要求每粒米 300 萬只以上。親米、生產(chǎn)米子孢子都需保存在 5176。C 冰箱內(nèi)。 工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米 (指收獲后的孢瓶在 10 天以內(nèi)使用 )接人含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi) ,28176。C 培養(yǎng) 5060h當(dāng) pH 值由 下降至 ,菌絲呈菊花團狀 ,平均直徑在 100130μm,每毫升的球數(shù)為 6 萬 8 萬只 ,沉降率在 85%以上 ,即可根據(jù)發(fā)酵罐球數(shù)控制在 800011000 只 /mL 范圍的要求 ,計算移種體積 ,然后接入發(fā)酵罐 ,多余的種子液棄去。球狀菌以新鮮孢子為佳 ,其生產(chǎn)水平優(yōu)于真空干燥的孢子，能使青霉素發(fā)酵單 位的罐批差異減少。 培養(yǎng)基成分的控制 產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (DE 值 50%以上 )進行流加。 氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補加無機氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。 生物合成含有芐基基團的青霉素 G, 需在發(fā)酵液中加人前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺 ,一次加入量不大于 %,并采用多次加入 ,以防止前體對青霉素的毒害。 加 入 的無機鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等 ,且用量要適度。另外 ,由于鐵離子對 青霉菌有毒害作用 ,必須嚴(yán)格控制鐵離子的濃度 ,一般控制在 30 μg/mL 發(fā)酵培養(yǎng)的控制 1)加糖控制 加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程中的 pH 值確定 ,最好是根據(jù)排氣中 CO2 量及 O2 量來控制 ,一般在殘?zhí)墙抵?%左右， pH值上升時開始加糖。 2)補氮及加前體 補氮是指加硫酸銨、氨水或尿素 ,使發(fā)酵液氨氮控制在 %%,補前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 %%。 3)pH 值控制 對 pH值的要求視不同菌種而異 ,一般為 ,可以補加葡萄糖來控制。目前一般 采用加酸或加堿控制 pH 值 4)溫度控制 前期 25176。C 26176。C,后期 23176。C,以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞 。 5)溶解氧的控制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的 30%。通風(fēng)比一般為 1:(L?min),攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。 6)泡沫的控制 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫 ,可以用天然油脂 ,如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑 泡敵 來消泡 ,應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入 ,尤其在發(fā)酵前期不宜多用 ,否則會影響菌體的呼吸代謝 7)發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣 ,用顯 微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵 ， 生產(chǎn)上慣稱 鏡檢 。 根據(jù) 鏡檢 中菌絲形變化和代謝變化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度 ,通過追加糖或補加前體等各種措施來延長發(fā)酵時間 ,以獲得最多青霉素。當(dāng)菌絲中空泡擴大、增多及延伸 ,并出現(xiàn)個別自溶細(xì)胞 ,這表示菌絲趨向衰老 ,青霉素分泌逐漸停止 ,菌絲形態(tài)上即將進入自溶期 ,在此時期由于茵絲自溶 ,游離氨釋放 ,pH 值上升 ,導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量下降 ,使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多 ,并使發(fā)酵液變稠 ,增加下一步提純時過濾的困難。因此 ,生產(chǎn)上根據(jù) 鏡檢 判斷 ,在自溶期即將來臨之際 ,迅速停止發(fā)酵 ,立刻放罐 ,將發(fā)酵液 迅速送往提煉工段。 4 工藝計算 表 1 工藝計算基礎(chǔ)數(shù)據(jù) 年產(chǎn)量 10000t 發(fā)酵單位 80000μ/ml 發(fā)酵周期 180h 成品效率 1000μ/mg 年工作日 320 天 發(fā)酵罐裝料系數(shù) 輔助時間 12h 種子罐裝料系數(shù) 消后大罐接種量 15% 種子罐發(fā)酵周期 60h 消后中罐接種量 8% 發(fā)酵期間補葡萄糖量 （ m3h ） 物料衡算 發(fā)酵周期 180h，輔助時間 12h，則產(chǎn)一批青霉素需要 8 天。每年共有： 每周期產(chǎn)量為 :10000247。40=250t 。 先選擇大罐 500 m3 發(fā)酵罐，則每個罐裝青霉素料 500= m3。 則每個發(fā)酵罐裝料量為 : m= m310 6ml80000μ/ml247。 1000μ/mg =109mg=。 則需要的罐體為 250247。=8 則此設(shè)計中選擇八個 500m3 的發(fā)酵罐來發(fā)酵罐。 年產(chǎn) 1 萬噸青霉素原料藥工廠發(fā)酵車間的設(shè)計 10 再選擇二級種子罐，接種量為 15%，在一個周期內(nèi) ,需要中罐裝料液體積： V=8500%15%= m3 則需要的罐體大小為： V 中 =247。%=600 m3 ； 則二級種子罐可選擇 100 m3 的六個。 二級種子罐接種量為 9%，所需種子罐裝料為 V=8%= m3 所需一級種子罐大小為 V 種子 =247。65%= m3。 可以選擇三個體積為 20 m3 的一級種子罐。 在整個發(fā)酵周期中，只考慮葡萄糖、硫酸銨、苯乙酸、消泡劑、氨水等的體積。 a)發(fā)酵培養(yǎng)基（ g/l） 表 2 發(fā)酵培養(yǎng)基用量 葡萄糖 10 K2HPO4 玉米漿 40 MgSO4˙7H2O 35 (NH4)2SO4 KH2PO4 則（ 1）葡萄糖： 每周期消耗量： 37510=3750kg 每年消耗量： 375040=150000kg=150t； （ 2）玉米漿： 每周期消耗量： 37540=15000kg 每年消耗量： 1500040=600000kg=600t； （ 3） (NH4) 2SO4： 每周期消耗量： 375= 每年消耗量： 40=85050kg； （ 4） K2HPO4: 每周期消耗量： 375=1500kg 每年消耗量： 150040=60000kg=60t； （ 5） MgSO4˙7H2O: 每周期消耗量： 37535=13125kg 每年消耗量： 1312540=525000kg=525t； （ 6） KH2PO4: 每周期消耗量： 375= 每年消耗量： 40=67950k