western-blot原理及操作流程1116(編輯修改稿)
2025-03-14 14:00 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 轉(zhuǎn)膜條件：推薦： 100V ， 1——2 小時(shí)；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。WesternBlot的具體步驟轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)：（ 立春紅染色） 為檢測(cè)轉(zhuǎn)膜是否成功，可用相關(guān)染料對(duì)膜進(jìn)行染色。為檢測(cè)轉(zhuǎn)膜是否成功，可用相關(guān)染料對(duì)膜進(jìn)行染色。1x立春紅5min染色前 染色后五、封閉五、封閉脫脂奶粉（含脫脂奶粉（含 5％％ 脫脂奶粉的脫脂奶粉的 TBST緩沖液緩沖液 ））BSAWestern Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供）膜封閉液（生物試劑公司提供）不能用于磷酸化蛋白！六、一抗、二抗孵育把 NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一抗溶液與濾膜溫育，室溫小時(shí)或 4℃ 過(guò)夜。倒掉一抗溶液，用 PBS漂洗濾膜 3次，每次 10min。加入配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)， 室溫一小時(shí)或4℃ 過(guò)夜。倒掉二抗溶液，用 PBS漂洗濾膜 3次，每次 10min。七、二抗與底物反應(yīng)顯色七、二抗與底物反應(yīng)顯色uECL化學(xué)發(fā)光顯色 比較常用，結(jié)果容易控制，但是被催化是 靈敏度差一點(diǎn)uDAB顯色 比較靈敏，是 HRP最敏感的底物Western Blot 需要的主要試劑主要試劑1. ?HCl （ ）Tris () 蒸餾水 100ml 溶解后，（用濃鹽酸調(diào) pH至 ），室溫下保存。 2. ?HCl（ ）Tris () 蒸餾水 100ml溶解后，（用濃鹽酸調(diào) pH至 ），室溫下保存。3. 10％ SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml 如溶解困難，可在 50℃ 水浴下溶解，室溫保存。 如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4. 10％過(guò)硫酸胺（ AP）過(guò)硫酸胺 蒸餾水 1ml （現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過(guò)硫酸胺干粉稱(chēng)好分量后放在 ，一次性多裝幾管，使用時(shí)加入蒸餾水水即可，溶解后， 4℃ 保存，保存時(shí)間為 1周 ）5． 四甲基乙二胺原液（ TEMED）： 4℃ 保存。6． 30%丙稀酰胺： 4 ℃ 保存。7． 5X電泳液緩沖液 Tris（ ） 甘氨酸（ ） 94g SDS 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存 ,
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