【文章內(nèi)容簡介】 種管和待接試管的管塞，然后讓試管口緩緩過火滅菌 (切勿燒得過燙 )。見圖 4— 6(a)所示。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 圖 4－ 6 試管拔塞后過火滅菌和取菌 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 8)塞管塞 取出接種環(huán) ， 灼燒試管口 ， 并在火焰旁將管塞旋上 。不要用試管去迎棉塞 ， 以免試管在移動時納入不潔空氣 。 9)將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 液體接種技術(shù) (1)用斜面菌種接種液體培養(yǎng)基時 ， 有下面兩種情況：如接種量小 ， 可用接種環(huán)取少量菌體移入培養(yǎng)基容器 (試管或三角瓶等 )中 ， 將接種環(huán)在液體表面振蕩或在器壁上輕輕摩擦把菌苔散開 ， 抽出接種環(huán) ， 塞好棉塞 ， 再將液體搖動 ， 菌體即均勻分布在液體中 。 如接種量大 ， 可先在斜面菌種管中注入定量無菌水 ． 接種環(huán)把菌苔刮下研開 ， 再把菌懸液倒入液體培養(yǎng)基中 ， 倒前需將試管口在火焰上滅菌 。 (2)用液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時，可用無菌的吸管或移液管吸取菌液接種。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 固體接種技術(shù) 固體接種最普遍的形式是接種固體菌制劑 。 因所用菌種或種子菌來源不同分為： 1)用菌液接種固體料 可用菌苔刮洗制成的懸液 。 接種時可按無菌操作法將菌液直接例入固體培養(yǎng)基中 ， 攪拌均勻 。 注意接種所用菌液量要計算在固體料總加水量之內(nèi) ， 否則往往在用液體種子菌接種后含水量加大 ， 影響培養(yǎng)效果 。 2)用固體種子接種固體料 包括用孢子粉 、 菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌 ， 直接把接種材料混入滅菌的固體料 。 接種后必須充分?jǐn)嚢?． 使之混合均勻 。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 穿刺接種技術(shù) 穿刺接種技術(shù)是一種用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法 。經(jīng)穿刺接種后的菌種常作為保藏菌種的一種形式 ， 同時也是檢查細(xì)菌運動能力的一種方法 ， 它只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng) 。 具體操作如下： (1)貼標(biāo)簽 。 (2)點燃酒精燈 。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 (3)穿刺接種 ， 方法如下： 1)手持試管 。 2)旋松棉塞 。 3)右手拿接種針在火焰上將針端灼燒滅菌 ， 接著把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也灼燒滅菌； 4)用右手的小指和手掌邊拔出棉塞。接種針先在培養(yǎng)基部分冷卻．再用接種針的針尖沾取少量菌種。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 5)接種有兩種手持操作法 。 一種是水平法 ， 它類似于斜面接種法 。 一種則稱垂直法 ， 如圖 4— 8所示 。 盡管穿刺時手持方法不同 ， 但穿刺時所用接種針都必須挺直 ， 將接種針自培養(yǎng)基中心垂直地刺入培養(yǎng)基中 。 穿刺時要做到手穩(wěn) 、 動作輕巧快速 ， 并且要將接種針穿刺到接近試管的底部 ， 然后沿著接種線將針拔出 。 最后 ， 塞上棉塞 ， 再將接種針上殘留的菌在火焰上燒掉 。 (6)將接種過的試管直立于試管架上，放在 37℃ 或 28℃ 恒溫箱中培養(yǎng)。 24h后觀察結(jié)果 (注意：若具有運動能力的細(xì)菌，它能沿著接種線向外運動而彌散，故形成的穿刺線較粗而散、反之則細(xì)而密 )。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 圖 4－ 7斜面劃線法（ a）和不同細(xì)菌直線接種長出的菌苔形態(tài)（ b） 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 圖 4－ 8 穿刺接種：（ a）水平穿刺接種；（ b）垂直穿刺接種 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 四、實驗報告 列表比較各種接種方法及注意事項 。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 五、問題和討論 上沾一下 ？ 2. 穿刺接種時能否將接種針直接穿透培養(yǎng)基？ 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 實驗三 熒光原位雜交法檢測活性污泥中的硝化細(xì)菌 Detection of Nitrifying Bacteria With Fluorescence In Situ Hybridization 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 一、實驗?zāi)康? ? 通過本次實驗掌握熒光原位雜交技術(shù)的 原理及操作方法； ? 通過本次實驗了解硝化細(xì)菌在活性污泥生物膜中的分布和數(shù)量。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 二、實驗原理 ? 原位定性、定量及相對定位檢測特定核酸序列的技術(shù)。 ? 雜交所用探針最早用位素作標(biāo)記，后來改用熒光作標(biāo)記，稱為熒光位雜交（ FISH， Fluorescence in situ hybridization ）。 雜交技術(shù) (in situ hybridization)， 1969年由 Pardue和 John等人發(fā)明，是在玻片或纖維膜上以標(biāo)記的單鏈核酸為探針，與組織或細(xì)胞中的特定 DNA序列進行雜，通過標(biāo)記信號的有無及強弱來定性、定量及相對定位檢測特定核酸序列的技術(shù)。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 ? 硝化細(xì)菌有亞硝酸細(xì)菌和硝酸細(xì)菌。 ? 亞硝酸細(xì)菌的探針： NSO190， 5’ CGATCCCTGCTTTTCTCC 3’ FAM 標(biāo)記（綠色）。 ? 硝酸細(xì)菌的探針： NIT3 5’ CCTGTGCTCCATGCTCCG 3’ ? HEX標(biāo)記（藍色）。 ? 竟?fàn)幮蕴结槪?CNT3 5’ CCTGTGCTCCAGGCTCCG3 ’ 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 三、主要實驗材料 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 主要試劑 探針、 1%稀鹽酸、雙蒸水、丙酮、 2%硅烷丙酮、明膠、明礬、 PBS， 4%多聚甲醛、 NaOH， 50%、 60%、 70%、80%及 96%的乙醇，熒光素 HAM、 HEX、雜交液。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 四、操作步驟 ? ? （ 1）、一般處理 熱肥皂水洗 自來水沖洗 1215次 蒸餾水沖 3次 1%鹽酸中浸泡24h 雙蒸水沖 3次 121度滅菌 20分鐘。 ? （ 2）硅化處理 70%乙醇洗 1分鐘 丙酮浸泡 1分鐘 2%硅烷丙酮浸泡 10S 丙酮浸泡 10S 蒸餾水浸泡 10S 雙蒸水沖 3次 50℃ 烘干 ? 涂片：活性污泥生物膜樣品直接涂布于硅化處理后的玻片上。 熱固定： 50 ℃ 烘 2h。 脫水：固定后樣品于 50%、 60%、 70%、 80%及 96%的乙醇脫中室 脫水 3min。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 ? 原位雜交反應(yīng)： 10uL探針 +90uL雜交液，混勻后取 510uL加到預(yù)處理過的樣品上，暗盒中 46℃ 雜交 23h。 探針的清洗：取出玻片，放入 50mL探針清洗液， 48 ℃ 浸泡 20min。雙蒸水室溫下漂洗 23次?？諝庵酗L(fēng)干。 ? ：用熒光顯微鏡觀察，采用藍色和綠色濾光片。拍照。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 五 .實驗的注意事項 ? ：玻片的預(yù)處理應(yīng)嚴(yán)格按操作步驟來做，避免有殘留的核酸。 ? ：將實驗室富集培養(yǎng)的硝化細(xì)菌經(jīng)過充分分散，稀釋 1000倍，取樣 50ul，與亞硝化細(xì)菌探針雜交。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 六、思考題 ? ？ ? ？ 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 附錄一 .雜交液的配制 探針 雜交液 去離子甲酰胺 /% SDS/ % TrisHCI，NaCI/mol/L ISO190 55 20 NI