【文章內(nèi)容簡介】 在 40%80%的成人中存在過感染， 可能會引起免疫排斥。 45 （ 1） 脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術 脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術使用方便、成本低廉。 基本原理 :利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源 DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源 DNA（ 即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達。 46 脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移示意圖 47 （ 2） 受體介導轉(zhuǎn)移技術 將 DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯(lián) ，可使 DNA具有靶向性 。 這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子 （ 如多聚賴氨酸 ） 來實現(xiàn) 。 多聚陽離子與配體共價連接后 ， 又通過電荷相互作用與帶負電荷的 DNA結(jié)合 ， 將 DNA包圍 ，只留下配體暴露于表面 。 這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲 ， 從而將外源 DNA導入靶細胞 。 48 受體介導轉(zhuǎn)移技術示意圖 49 （ 3） 基因直接注射技術 不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因 DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 動物實驗表明：接受注射外源 DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應的蛋白質(zhì)，并能維持數(shù)月之久。 心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細血管增加 30%～ 40%； ，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； Ⅸ 基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。 50 基因直接注射法的優(yōu)點 DNA重組體的技術較容易； ； ，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點； ，而病毒載體則可能誘導體內(nèi)免疫應答，致使反復治療效果下降。 51 三、基因干預 Gene Interference 52 基因干預的種類： ? RNA (antisense RNA) ? RNA (RNA interference) ? (ribozyme) 53 （一）反義 RNA 1. 反義 RNA與基因表達調(diào)控 利用反義 RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （ 1）體外合成反義 RNA， 直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收 RNA后，發(fā)揮作用。 （ 2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義 RNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，轉(zhuǎn)錄出反義 RNA而發(fā)揮作用。 54 反義 RNA的關鍵技術問題： ?反義 RNA進入靶細胞前的降解問題 ?專一性轉(zhuǎn)移問題： 55 RNA技轉(zhuǎn)移術 ①受體介導的 RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高； ②被轉(zhuǎn)移的 RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層 , 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。 將 脫唾液酸血清類粘蛋白 （ ASGP） 與多聚賴氨酸 （ PL）共價連接 ， 得到 ASGPPL復合物 ， 成為運載核酸的工具 。ASGPPL反義 RNA復合物可以專一性地被肝細胞表面的 ASGP受體所識別 ， 并吞噬到肝細胞中 ， 反義 RNA進入肝細胞后 ，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用 。 借助受體介導 DNA轉(zhuǎn)移方法把 DNA換成反義 RNA， 就可以實現(xiàn)受體介導的反義 RNA的轉(zhuǎn)移 。 56 3. 反義 RNA的應用前景 受體介導的反義 RNA基因治療有其自身的優(yōu)點 ， 而在 一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療的不足 。 （ l） 安全性高 （ 2） 反義 RNA設計和制備方便 （ 3） 具有劑量調(diào)節(jié)效應 （ 4） 能直接作用于一些 RNA病毒 反義 RNA只作用于特異的 mRNA分子 ， 不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu) 。 反義 RNA分子無論怎樣修飾 ， 最終將在細胞內(nèi)部被降解 ， 不留“ 殘渣 ” 。 在治療 RNA病毒感染性疾病時 ， 受體介導的反義 RNA基因治療比一般的 DNA基因治療有更大的優(yōu)勢 。 利用反義 RNA可以直接作用于病毒 RNA， 阻斷 RNA病毒的繁殖 。 57 （二）干擾 RNA 實驗結(jié)果顯示，有義鏈 RNA（ sense RNA） 或反義鏈RNA（ antisense RNA） 均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈RNA比單鏈 RNA更為有效。將特異的雙鏈 RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈 RNA都同樣阻斷基因表達途徑。這與傳統(tǒng)上對反義 RNA技術的解釋正好相反。而且其抑制基因表達的效率比反義 RNA至少高 2個數(shù)量級。 RNA干擾 （ RNA interference， RNAi） 是一種由雙鏈 RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈 RNA有同源序列的信使 RNA（ mRNA） 被降解，從而抑制該基因的表達。 對 RNA干擾的認識來源于用線蟲（ C. elegans） 和果蠅所進行的實驗。 58 RNA干擾過程主要有 2個步驟： （ 1）小干擾性 RNA（ siRNA） （ 2） siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為 RNA誘導的沉默復合體（ RNAinduced silencing plex, RISC)。 該復合體可識別與 siRNA有同源序列的mRNA， 并在特異的位點將該 mRNA切斷。 長雙鏈 RNA被細胞內(nèi)的雙鏈 RNA特異性核酸酶 Dicer切成 2123個堿基對的短雙鏈RNA， 稱為小干擾性 RNA（ small interfering RNA， siRNA）。 59 A. 賈第鞭毛蟲 Dicer的晶體結(jié)構(gòu)； RNA干擾機制示意圖 60 1. 體外化學合成 。 2. 用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細胞內(nèi)穩(wěn)定地生成 。 siRNA的產(chǎn)生 61 RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉(zhuǎn)導等廣泛領域取得了令人矚目的進展，使其在醫(yī)學、生物學領域的應用有著廣闊的前景。 62 （ 1） 研究基因功能的新工具 由于 RNA干擾技術具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。 RNA干擾技術能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段， 產(chǎn)生類似基因敲除的效應 。 63 （ 2） 腫瘤的基因治療 傳統(tǒng)反義 RNA技術誘發(fā)的單一癌基因的阻斷 ， 不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長 ， 而 RNA干擾技術可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性 ， 設計針對這一區(qū)段序列的雙鏈 RNA分子 ，只使用一種雙鏈 RNA即可以產(chǎn)生多個基因同時剔除的表型 ， 也可以同時使用多種雙鏈 RNA而將多個序列不相關的基因同時剔除 。 RNA干擾技術可用于治療有異?；虮磉_的惡性腫瘤 。 KRAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需 ， bcr/ab1融合基因與人白血病有關 ， 用 RNA干擾技術可以阻礙 KRAS蛋白的表達從而抑制腫瘤發(fā)生 ， 或殺死有 bcr/ab1的人白血病細胞系 。 通過 RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達 ， 能促進白血病細胞系的細胞凋亡或增加其對化療藥物的反應性 。 應用 RNA干擾技術成功地阻斷了 MCF7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關的核轉(zhuǎn)錄因子基因 Sp1的功能 。 64 （ 3） 病毒性疾病的基因治療 RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機制 。 用 siRNA抑制人類免疫缺陷病毒 （ HIV） 某些基因的表達 ， 如 P2 Vif、 nef、tat或 rev， 阻礙 HIV在細胞內(nèi)復制 。 用 RNA干擾技術抑制 HIV 的受體 （ CD4） 或輔助受體（ CXCR4或 CCR5） 在細胞內(nèi)表達 ， 可 阻礙 HIV感染細