【文章內(nèi)容簡介】 空白 。 ? (2)可闡明上述極端微生物 雜環(huán)降解途徑和反應(yīng)機制 ： ? 生長體系雜環(huán)化合物的降解機制； ? 休止細胞雜環(huán)化合物的降解機制； ? DBT、 THA、 CA和長鏈烷烴分解途徑的酶反應(yīng)機制及其某些關(guān)鍵基因 。 ? ? (3)該項目的相關(guān)的研究內(nèi)容及研究方法分別可在國內(nèi)外重要雜志每年有 4篇以上高質(zhì)量的論文發(fā)表。申報 2~3項國內(nèi)外發(fā)明專利 。 ? (4)分離、克隆 3~4個具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的具有特殊降解雜環(huán)功能基因；提供 3~4株有明顯降解處理石油廢水能力的菌株。 ? ? 六、預(yù)期可獲得的發(fā)明專利等知識產(chǎn)權(quán) 根據(jù)我們所掌握的信息資料 ， 至少在下列內(nèi)容可申報獨立的發(fā)明專利權(quán)(見查新證明書 )： ? (1)耐熱微生物處理含氮 、 含硫廢水； ? (2)超高溫微生物處理石油廢水 。 ? (3)石油廢水油水分離的微生物技術(shù)； ? 如果經(jīng)費充足 ， 我們擬申報 1~2項國際專利 。 選取 34株耐有機溶劑、耐高溫菌株進行模式化合物研究，降解率達到 80% 每年 4篇以上高水平的論文 分離、克隆 34個功能基因片斷 申報 23項 專利 生長體系、催化劑降解機制研究 在采油廠進行石油廢水處理，日處理量達到 100200立方，對雜環(huán)及有機烴類降解率達到 90% DNA改組進行改造，提高降解活力、底物作用范圍 填補特殊菌 雜環(huán)及有機烴 降解的某些研究空白 主要研究內(nèi)容及預(yù)期達到的目標總圖 八、研究方法與實施方案 ? 1 研究方法 ? (1) 定性確定極端微生物可能的雜環(huán)降解途徑 ? 利用 GC/MS定性測定雜環(huán)降解途徑中的各反應(yīng)物 ， 代謝中間物和最終產(chǎn)物 。 ? (2) 定量確定極端微生物雜環(huán)降解活力 ? 利用 GC定量測定各種反應(yīng)物和產(chǎn)物 ， 同時尋找比色方法 ， 如與Gibbs顯色法測定代謝反應(yīng)終端產(chǎn)物 (HBP和 DHBP)的方法進行比較 。 (3) 雜環(huán)降解基因克隆方案 (a) 質(zhì)粒分離： 使用熱突變或化學(xué)突變，驗證菌株降解有機污染物的性狀是否丟失。如果性狀丟失，那它就是由質(zhì)?？刂频?，則提取質(zhì)粒，通過酶切轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，獲得該 DNA片段。反之，則采取下述方案。 (b) 染色體上目的基因的定位克隆 ： 目的基因在染色體上，采用 AFLP分子標記進行基因定位。 發(fā)酵設(shè)備及檢測控制系統(tǒng) ?? B|Braun公司 B i o s t a t B 2pO2 (%) t i m e ( h )B i o s t a t U D 5 0M F C S C o n t r o lb f xh g fxchgf(4)雜環(huán)降解生物催化劑大量制備： 用申請者所在課題組從德國貝朗公司引進的計算機全自動控制的2 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵，提供該項研究所需要的大量的具有高降解活力的菌體。 酶的性質(zhì)及 結(jié)構(gòu)分析 以噻吩為模式物進行有機硫雜環(huán)降解研究 以咔唑為模式物進行有機氮雜環(huán)降解研究 以石蠟為模式物進行有機烴降解和油水分離機理研究 基因分離、克隆 酶的分離 及純化 質(zhì)粒的分離 以 AFLP 為分子標記，克隆染色體上功能片斷 分子改造，并在異源宿主內(nèi)進行高效表達 應(yīng)用 GCMS研究 菌株的代謝途徑 進行小規(guī)、中試 模的廢水處理試驗 發(fā)酵罐 培養(yǎng)采取的研究方法（技術(shù)路線、實施方案）總圖 微生物技術(shù) 環(huán)境工程 化學(xué)與化學(xué)工程 山東大學(xué) 環(huán)境生物技術(shù)研究小組 脫有機硫微生物 脫有機氮微生物 具有油水分離功能 的微生物 嗜熱、抗有機溶劑 特殊微生物 耐熱細菌生物脫有機硫模式反應(yīng)體系的研究 提綱 1. 生物脫硫的意義和背景 2. 微生物脫硫的途徑 3. 我們的研究進展 4. 生物脫硫的實際應(yīng)用 1. 生物脫硫背景 ? 環(huán)境問題已成為影響人類生存的重大問題，化石燃料煤和石油中所含有的硫是環(huán)境的主要污染源之一。 ? 微生物脫硫操作簡單，成本低。 ? 脫有機硫是一個世界性難題，已受到廣泛關(guān)注。 化石燃料煤和石油中所含有的有機硫和無機硫是環(huán)境的重要污染源 ? 嚴重性 1998年我國有一半以上城市降水 pH低于 。 華中地區(qū)酸雨出現(xiàn)頻率大于 70%， 降水的年均 pH低于 ，酸雨面積占國土面積的 30%， 是繼歐洲 、 北美后世界第三大中酸雨區(qū) 。 ? 迫切性 隨著能源危機的逐步加劇 ，開采高硫化石燃料成為必然 。 高硫化石燃料必須預(yù)先經(jīng)過脫硫處理才能進一步使用 。 ?煤炭的化學(xué)結(jié)構(gòu)模型 石油大分子的放大結(jié)構(gòu)圖 有機硫類型 有機硫化物包括硫醇、硫化物及含硫的雜環(huán)化合物如噻吩等，共分為 13類 ,包括 176種不同結(jié)構(gòu)，其中噻吩含量最多。 ?M e rp c a p t a n s (t h i o l s )S HS HS HS u l p h i d e s (a l i p h a t i c o r a ro m a t i c ) a l k y l c y c l i c a ro m a t i c d i a l k y l a l k y l c y c l o a l k y l c y c l i c a l k y l a ry l t h i a i n d a n sD i s u l p h i d e sT h i o p h e n e sa l k y l b e n z o t h i e n o d i b e n z o S SSSSSSS S SSS煉油過程中物理和化學(xué)的除硫成本大 ? 原油中大多數(shù)的 H2S是在油井現(xiàn)場的油氣分離過程中除去的。 ? 在煉油廠采用催化裂解和加氫脫硫(HDS)過程，加熱到 350?C后蒸餾除去結(jié)合硫，但這些技術(shù)需高溫、高壓，且能耗大。 ? 目前相當(dāng)多的資金用于石油的物理化學(xué)法脫硫上， 1993年全世界用于 HDS過程的資金達 250億美元 。 ? 到下個世紀，隨著需求的增加和低硫原油的耗盡，高硫原油將不斷增加，因此石油脫硫成為必然。 ?生物脫有機硫的優(yōu)勢 ? BDS在常溫常壓下操作， 而且能耗比HDS低 70%80。 ? 該過程還可回收有機磺酸鹽等高值化學(xué)品，可為煉油廠增加經(jīng)濟效益。 采用 BDS技術(shù)的投資額約為加氫脫硫技術(shù) (HDS)的一半，操作費用比 HDS低 10%25%。 ? 據(jù)報道，采用 BDS可使 FCC汽油的硫含量從 1400ppm降至 150ppm(以滿足整個汽油組分平均硫質(zhì)量含量為 50ppm的要求 )。 ? 從整個汽油組分來講，煉油廠每 m3成品汽油的 BDS成本 $， 低于 HDS成本。 ?2. 微生物脫硫的途徑 ① 以二苯并噻吩為模式化合物的脫硫途徑 ② 以苯并噻吩為模式化合物的脫硫途徑 ③ 以噻吩為模式化合物的脫硫途徑 ① 二苯噻吩 (Dibenzothiophene, 簡稱 DBT)被作為一個脫有機硫 模式化合物 來研究 ? 在高餾分油中，超過 60%的硫是以二苯噻吩(Dibenzothiophene，簡稱 DBT）及其衍生物的形式存在的，因此實驗室一般使用DBT作為生物脫硫研究的模式化合物。 (Thiophene)噻噻SThiophenesSalkylbenzoSSthienoS(dibenzo)S噻噻 ( )噻噻噻_噻噻_噻噻_( )( )噻噻噻_( )生物脫有機硫代謝途徑類型 ? (1) 碳架破壞途徑 (CC鍵被切斷 ) ? (2)碳架保留途徑 (專一地切斷 CS鍵而保留完整的碳架 ) (1) 碳架破壞途徑 (CC鍵被切斷 ) (1)碳架保留途徑 (專一地切斷 CS而保留完整的碳架 ) ② 苯并噻吩（ Benzothiophene，BTH）脫硫代謝途徑 ? FCC汽油 中主要的含硫有機化合物包括 BTH及其衍生物，其中 BTH占 30%。 ? Finnerty et al.（ 1983）報道了幾株可以利用 BTH為專一硫源和碳源進行生長的菌株，不過由于其損失燃料熱值而沒有應(yīng)用價值。 ? 近幾年發(fā)現(xiàn)能夠了 專一性降解 BTH菌株，主要包括戈登氏菌株，類芽孢桿菌，中華根瘤菌以及紅球菌。 FCC汽油中硫化合物的分布及煉制油品要求 含硫化合物 含硫量 (ppm) 煉制汽油硫含量 (ppm) Mercaptans 6 8 Thiophene 52 66 C1Thiophene 66 167 Tetrahydrothiophene 16 21 C2Thiophene 183 233 C3Thiophene 126 80 C4Thiophene 139 0 Benzothiophene 309 0 微生物脫有機硫 — BTH降解途徑 SSOSO OOSO OSOOO HOO HOABCDEFGH? A是 BTH ? B是 BTH sulfoxide ? C， D是 BTH sulfone ? F是 benzo[e][1,2]oxathiin Sxoide ? E是 ohydroxystyrene ? G是 2(2’hydroxyphenyl) ethan1al ? 微生物包括： ? 戈登氏菌株（ Gordonia sp.）213E ? 類芽孢桿菌（ Paenibacillus sp.）A112 ? 紅球菌（ Rhodococcus sp.） T09 ? 中華根瘤菌（ Sinorhizobium sp.）KT55 ? 紅球菌 KT462 ③ 噻吩（ Thiop