如何尋找mirna靶基因(編輯修改稿)
2025-09-14 16:32 本頁面
【文章內容簡介】 iRNA上述不同算法各有其特點，主要還是依據miRNA與其靶位點的互補性、miRNA靶位點的保守性、miRNAmRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性及附近序列的二級結構等原則設計的。其中，miRanda是將miRNAmRNA之間的序列匹配，保守性及熱穩(wěn)定性作為計算參數，有比較好的檢出率，但是假陽性率也較高；TargetScan提出了“種子區(qū)”的概念，增加了預測的精確度；RNAhybrid的研究重點在RNA二級結構預測方面，能夠更快速準確地計算miRNAmRNA雙鏈的自由能，降低了假陽性率；DIANAmicroT則主要考慮miRNA調控單個靶基因的情況，同時考慮中央突起以及miRNA在3’端與mRNA的結合；RNA22與其他算法不同，不考慮物種間的保守性，檢出率較高。生物學實驗方法由于計算機模擬在預測miRNA靶基因時存在一定的局限性，因此很多學者也希望能夠利用生物學實驗方法直觀地尋找miRNA靶基因。(1) 從mRNA水平尋找miRNA靶基因（a）miRNA靶基因大規(guī)模尋找將miRNA成熟體雙鏈或腺病毒載體轉染至細胞中，使得miRNA在細胞中過表達，之后利用基因芯片分析mRNA的變化以找出相應miRNA的靶基因[9]。由于miRNA在體內通過翻譯抑制或影響mRNA的穩(wěn)定性起作用，因此這種方法在尋找起翻譯抑制作用的miRNA的靶基因時存在一定困難。Beitzinger等人[10]利用AGO蛋白家族既能結合miRNA又能結合mRNA的特性，分別使用AGO1和AGO2蛋白的單克隆抗體在人類細胞中進行免疫共沉淀，得到與AGO1和AGO2蛋白結合的mRNA各600條，并通過克隆測序對這些mRNA進行鑒定。同時，從與AGO1蛋白結合的mRNA中隨機挑選6條進行熒光素酶報告基因檢測，發(fā)現其中有5條都是miRNA的靶基因。與上述工作類似, Easow等人[11]也是利用純化miRNP來分析miRNA的靶基因。他們利用基因芯片分析了miRNP結合的mRNA后發(fā)現，大量計算機預測的miRNA靶基因得到了富集，同時為了分析單個miRNA的靶基因，對野生型果蠅和miR1缺失果蠅的miRNP結合mRNA進行了分析，得到并利用實驗方法鑒定miR1調節(jié)的mRNA，為miRNA靶基因的尋找提供了新的思路。（b）miRNA靶基因的精確尋找Liu等人[12]在研究Mir16家族的功能時建立了一種針對miRNA靶基因的反向篩選法。首先，確定了感興趣的基因cd1，將它的3’UTR構建到熒光素酶報告載體中，之后與構建的miRNA表達文庫共轉染HepG2細胞，得到熒光值明顯下降的miRNA，再將得到的miRNA在體內驗證其功能，最終得到Mir16家族能夠調節(jié)CCND1基因。該方法的關鍵在于，利用了自行構建的miRNA表達文庫，能夠方便同時研究多條miRNA，通過體外實驗對候選miRNA進行初步篩選，從而快速地鑒定一條mRNA所對應的多條miRNA。（2）從蛋白質水平尋找miRNA靶基因 由于miRNA所介導的轉錄后翻譯抑制過程不引起mRNA水平的改變，因此依據mRNA水平的變化尋找miRNA靶基因的方法在檢出率上存在一定問題。Selbach[13]和Baek[14]兩個研究組分別利用蛋白質組學的研究方法，建立了從蛋白質水平尋找miRNA靶基因的新方法。兩個課題組分別將成熟miRNA雙鏈轉染HeLa細胞，利用細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記技術（stable isotope labeling with amino acids in c
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