真核表達(dá)系統(tǒng)(編輯修改稿)
2025-09-11 23:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 tk）選擇系統(tǒng) ?二氫葉酸還原酶基因（ dhfr）選擇系統(tǒng) ?新霉素抗性基因（ neo）選擇系統(tǒng) ?氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ cat）選擇系統(tǒng) 胸苷激酶（ TK）基因選擇系統(tǒng) ?TK是核苷酸補(bǔ)救合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶 ?內(nèi)源性缺陷 tk的宿主細(xì)胞 —— 小鼠 LMTK—細(xì)胞 ?HAT選擇法 ?H：次黃嘌呤；補(bǔ)救合成三種核苷酸的原料 ?A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成 ?T：胸苷；補(bǔ)救合成 dTTP的原料 ?tk— 細(xì)胞的鑒別與獲得： 5`溴脫氧核糖尿苷（ BUdR）篩選 二氫葉酸還原酶（ DHFR）基因選擇系統(tǒng) ?DHFR：真核細(xì)胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸 ?篩選劑：葉酸類似物 —— 氨基喋呤或氨甲喋呤 ?dhfr— 缺陷型細(xì)胞 —— CHO細(xì)胞 ?正常細(xì)胞可通過提高氨甲喋呤濃度篩選 ?突變型 dhfr基因的導(dǎo)入擴(kuò)大篩選宿主細(xì)胞的范圍 新霉素抗性基因選擇系統(tǒng) ?新霉素（ neo）：即 G418，一種氨基糖苷類抗生素，影響 80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成 ?新霉素抗性基因編碼 3`磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418 ?適用于所有的真核細(xì)胞 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ CAT）基因選擇系統(tǒng) ?CAT：大腸桿菌 Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素乙酰化反應(yīng)的蛋白質(zhì) ?真核細(xì)胞缺乏 CAT ?導(dǎo)入 CAT可作為報(bào)告基因 ?常用于瞬時(shí)表達(dá)研究 表位標(biāo)記 ?表位：抗原決定簇即抗原分子于一特定抗體結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，一般由少至幾個(gè)氨基酸的多肽組成 ?用于重組 DNA技術(shù)的示蹤、分析、純化（親和） ?優(yōu)點(diǎn) ?用一種抗體可鑒別不同重組蛋白 ?不影響蛋白功能 ?有利于研究蛋白功能 ?常用表位： 6His； FLAG； LZ等 構(gòu)建含表位的重組體 ?使用常用密碼子 ?注意克隆位點(diǎn)（限制性酶切位點(diǎn)）相符 ?5`端加上起始密碼子 ATG ?3`端加上終止密碼子 ?可插入蛋白酶切位點(diǎn)基因，以利于產(chǎn)生天然蛋白 ?其他常規(guī)構(gòu)建載體的注意點(diǎn) 真核表達(dá)載體 ?質(zhì)粒：真核表達(dá)元件、真核抗性 ?病毒載體：改建后 ?SV40病毒 ?腺病毒 ?反轉(zhuǎn)錄病毒 ?痘苗病毒 病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ? 病毒基因組大小相差較大 ,與細(xì)菌或真核細(xì)胞相比，病毒的基因組很小 ? 病毒基因組可以由 DNA組成，也可以由 RNA組成 ? 多數(shù) RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成 ? 基因重疊即同一段 DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子 ? 病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的 ? 病毒基因組 DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位 ,形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元 ? 除了反轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個(gè)基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次 ? 噬菌體（細(xì)胞病毒）的基因是連續(xù)的；而真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的 病毒載體優(yōu)點(diǎn) ?真核細(xì)胞可識(shí)別的啟動(dòng)子 ?報(bào)告基因 ?可持續(xù)復(fù)制（感染周期） ?部分載體可整合入基因組 ?部分載體本身帶有完整的復(fù)制及表達(dá)元件
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