培訓(xùn)課件：酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)操作注意事項(編輯修改稿)
2024-09-05 15:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 以免發(fā)生交叉污染。 ?（ 3）加酶結(jié)合物、加底物，應(yīng)使加液量準(zhǔn)確均一、加液過程迅速完成。也可使用試劑盒提供的滴瓶直接滴加。滴加時，除了要注意滴加的角度垂直、一致外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象。 4 溫育 ?溫育是 ELISA測定中影響測定成敗 最為關(guān)鍵 的一個因素。 ? ELISA屬于固相免疫測定，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異性抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定溫度條件下反應(yīng)一定的時間。一般溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，所需時間相對較短。最為常用的溫度有 37℃ 和室溫 (20－25℃ )，其次是 43℃ 和 2－ 8℃ ，目前國內(nèi) ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時間通常為 37℃ 30－ 60分鐘 ?關(guān)于溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點： ?（ 1）要保證 在設(shè)定的溫度下 有 足夠的反應(yīng)時間 。 ?一般來說，加完樣本或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃ ，需要一定的時間，尤其是在 室溫比較低 以及非水浴的狀態(tài) 下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成在實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。 ?為保證 37℃ 下足夠的溫育時間，實驗室水浴狀態(tài)應(yīng)保證微孔 板底貼著水面 ，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)貼片或封蓋。 ?（ 2）溫育溫度的選擇。 ?在有的 ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是 37℃ 下 1小時，另一種則為 43℃ 下 45分鐘。從免疫測定抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來看，在較低的溫度下反應(yīng)較長的時間最為完全，產(chǎn)物最穩(wěn)定。如 2－ 8℃ 下反應(yīng) 24小時。較高的反應(yīng)溫度，由于分子運動的加快，反應(yīng)時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，如須選擇反應(yīng)條件，建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫度較長反應(yīng)時間的條件。 ?（ 3）“邊緣效應(yīng)”的排除。 ?以前在使用 96孔板的 ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實驗室的常規(guī) ELISA測定中，將板從室溫臵于 37℃ 溫箱 (非水浴 )，板孔升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。 ?而將 ELISA板臵于水浴箱中， ELISA板底應(yīng)貼著水面，可使溫度迅速平衡。讓反應(yīng)板飄浮在水面上。就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測定的重復(fù)性。 5 洗板 ?洗滌在 ELISA雖不是一個反應(yīng)步驟，但也 決定著實驗的成敗 。 ELISA就是靠洗滌清除殘留在板孔中沒能與固相抗體（抗原）結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性的吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，以保證 ELISA測定的
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