【文章內(nèi)容簡介】 宿主：轉(zhuǎn)化酵母原生質(zhì)體 ? 載體篩選：顯性篩選標(biāo)記 (營養(yǎng)缺陷型的恢復(fù) ) ? 重組篩選：插入片段大小 ? 供體 DNA大?。?2022kbp ? 主要應(yīng)用：大基因組分析， YAC轉(zhuǎn)基因小鼠 ? 評論： YAC的缺點是高頻率的自發(fā)缺失，和克隆的嵌合化。重組載體的大小，需要電泳分析，有時難以區(qū)分內(nèi)源性染色體。 YAC維持低拷貝。 C E N 4 E c o RI A R S I S U P 4 T R P I A m p U R A 3 D N A o r i E c o RI 部 分 酶 切 T E L T E L B a m H I B a m HI B a m H I 和 P F E G ( p u l s e d f i e l d g e l E c o l i 雙酶切 e l e c t r o p h o r c s i s ) 脈 沖 電 泳 變 角 電 場 電 泳 連接 第三節(jié) 文庫的篩選 ? 一 .基因組 DNA文庫的篩選 ? 篩選 DNA文庫是分離目的基因常用的方法； 在成千上萬的克隆中僅極少數(shù)含目的基因，且 大多數(shù)基因的產(chǎn)物不具有可選擇的表型特征， 因此可采用以下策略來進(jìn)行篩選： (1)用特異探針進(jìn)行分子雜交； (2)用免疫和生化方法來檢測基因產(chǎn)物； (3)用特異性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 二 .cDNA的篩選 ? (1)最佳的 cDNA文庫其 mRNA在細(xì)胞中高水平特異表達(dá)； ? (2)有的目的 mRNA的豐度極低，那么就應(yīng)選擇其豐度相對較高的細(xì)胞來構(gòu)建文庫，并要計算好文庫應(yīng)具有的克隆數(shù)； ? (3)細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的表達(dá)量常常是表明mRNA豐度的敏感指標(biāo)。 表 2 4 . 4 根 據(jù) 所 提 供 的 來 源 和 信 息 ， 從 cDNA 或 基 因 組 文 庫 中 分 離 基 因 的 策 略所 提 供 的 信 息 篩 選 策 略功 能 克 隆 不 需 要 表 達(dá)高度度 m R N A 豐 富 克 隆 — 從 c D N A 文 庫 中 隨 機(jī) 選 擇 克 隆 ， 測 序 確 定 產(chǎn) 物已 知 部 分 序 列 用 寡 核 苷 酸 探 針 篩 選a有 部 分 克 隆 或 同 源 序 列 在 低 嚴(yán) 格 條 件 下 用 克 隆 的 片 段 或 同 源 基 因 篩 選已 知 部 分 多 肽 序 列 用 簡 并 性 寡 核 苷 酸 [ 猜測體 ( g u e s s m e r s ) ] 篩 選 文 庫兩 種 組 織 中 表 達(dá) 差 異 差 減 篩 選 ， 通 過 差 減 雜 交 得 到 富 含 差 異 表 達(dá) 克 隆 的 文 庫c D N A 表 達(dá) 的 功 能 克 隆提 供 突 變 通 過 對 突 變 表 型 的 互 補 篩 選 ( 表 型 恢 復(fù) )提 供 抗 體 同 免 疫 檢 測 篩 選 文 庫特 異 性 的 產(chǎn) 物 通 過 特 殊 技 術(shù) 篩 選 文 庫 ， 如 對 DNA 結(jié) 合 蛋 白 的 southweat ern 雜交 ， 相 互 作 用 蛋 白 的 酵 母 雙 雜 交 體 系 ， 酶 對 底 物 的 轉(zhuǎn) 化 等定 位 克 隆提 供 結(jié) 構(gòu) 突 變 如 果 突 變 由 缺 失 引 起 ， 從 基 因 組 消 減 文 庫 來 克 隆由 轉(zhuǎn) 座 子 插 入 引 起 的 突變?nèi)?果 突 變 由 插 入 或 轉(zhuǎn) 座 子 件 引 起 ， 用 轉(zhuǎn) 座 序 列 作 為 探 針 篩 選 突變 體 文 庫 ， 通 過 質(zhì) 粒 拯 救 分 離 克 隆基 因 在 染 色 體 上 的 位 置 通 過 從 相 關(guān) 標(biāo) 記 或 染 色 體 斷 點 相 連 接 的 染 色 體 步 移 ( chromoso mew a l k i n g , ) 定 位 克 隆 ， 標(biāo) 記 可 能 是 增 強 子 包 載 載 體 的 轉(zhuǎn) 座 因 子非 篩 選 方 法基 因 組 作 圖 和 測 序 對 整 個 基 因 組 系 統(tǒng) 化 分 析表 達(dá) 序 列 標(biāo) 記 對隨機(jī) c D N A 克 隆 的 大 量 克 隆 和 分 析a 以 P C R 為 基 礎(chǔ) 的 方 法 也 可 應(yīng) 用? 探針的特異性可通過以下的策略來解決： ①選基因的特異序列為探針； ②長度不低于 17～ 20Nt； ③控制退火溫度。 ? 堿基的簡并性可通過以下的策略來解決： ①選用簡并程度最低的序列； ②選用使用頻率最高的密碼子； ③簡并密碼子的第 3個堿基可用 H； ④應(yīng)用混合探針； ⑤控制退火溫度。 三 . 應(yīng)用寡核苷酸探針來分離目的基因 (1)從某一物種分離到的基因序列可作為另一物種的核酸探針； (2)由蛋白質(zhì)保守區(qū)中相鄰的 6～ 7個氨基酸推導(dǎo)合成出核酸探針。 合成探針時必須考慮到： ①探針的 特異性 ； ②堿基的 簡并性 。 四 .假陽性克隆的克服 ? 應(yīng)用混合探針分離克隆基因雖取得了良好的效果，但也會產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的假陽性。克服假陽性的方法有二 : ? (1)制備“ 猜測體 (guessmer)” 探針 猜測體 探針是根據(jù)特定物種某已知蛋白的密碼子使用頻率，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質(zhì)區(qū)段進(jìn)行人工合成的低簡并性寡核苷酸探針。 TC CTAGAGAGCT 保 守 的 氨 基 酸 序 列 C y s － M e t － A s p － G l u － M e t － L y s － A r g － A s n － I l e 特異的 DNA 序列 A T G A T G G A G A A T G A A A G – A A A T T C 簡 并 的 探 針 含 8 種 不 同 序 列 A C G C T G T A T G G A T G A A A T G A A G TG C A T G G A T G A A A T G A A T T G T A T G G A C G A A A T G A A TG C A T G G A C G A A A T G A A T G T A T G G A T G A G A T G A A TG C A T G G A C GA G A T G A A TG C A T G G A T G A G A T G A A T G T A T G G A C GA G A T G A A 同 c D N A 文 庫 雜 交 唯 一 的 “ 猜 測 體 ”5 ’ T G C A T G G A C G A G A T G A A G C G C A A C A T C 3 ’ 同克隆基因雜交的正確序列 5 ’ TG C A T G G A C G A A T G A A 3 ’ A C G T A C C T G C T T T A C T T C G C G T T A T A G 猜測體與克隆基因雜交存在錯配 G C5 ’ T G C A T G G A C G A A T G A A G C G C A A A T C 3 ’ A C G T A C C T G C T T A C T T C G C