【文章內(nèi)容簡介】 ord neurons. Lancet, 2000, 355 (9218): 1890(3) McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11(3): 233249(4) Natarajan D, Grigoriou M, MarcosGutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Development, 1999,126:157168(5) 劉平，盧亦成，朱誠。中樞神經(jīng)干細(xì)胞。中華神經(jīng)外科雜志。2000，16（3）：196198(6) Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364370—33—三、研究方案1. 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)： 　　探索建立針對先天性巨結(jié)腸癥的MSC，神經(jīng)干細(xì)胞移植治療方法。研究內(nèi)容：１． MSC的分離，體外克??；２． MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；３． 多種人工修飾條件下的神經(jīng)干細(xì)胞在HD動物模型（lethal spotted rat, ls/ls）無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段移植，定向分化；４． 鑒定神經(jīng)干細(xì)胞移植后HD動物模型的消化道神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及機(jī)能。擬解決的關(guān)鍵問題：１． MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；２． 神經(jīng)干細(xì)胞的基因修飾； ３． 神經(jīng)干細(xì)胞移植，定向分化的分子機(jī)制。－4－2. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析研究方法：１． 無血清培養(yǎng)，單細(xì)胞克隆技術(shù)；２． mRNA差異消減顯示技術(shù)；３． 原位雜交；RTPCR，免疫組化技術(shù)，透射電鏡技術(shù)；４． 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。技術(shù)路線： 建立HD動物模型 MSC的分離及體外培養(yǎng)MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，克?。╒MYC，EGF等多種基因轉(zhuǎn)染，修飾）神經(jīng)干細(xì)胞移植到HD動物無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段誘導(dǎo)分化（維甲酸等） mRNA差異消減顯示技術(shù)顯示神經(jīng)干細(xì)胞移植分化的分子機(jī)制 觀察無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及功能獲得通過MSC、神經(jīng)干細(xì)胞移植對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的方法－51－—52—實(shí)驗(yàn)方案：第一部分：建立HD動物大鼠參照文獻(xiàn)進(jìn)行大鼠選育，源于WistarImamichi AR系，HD大鼠均結(jié)腸造瘺處理。第二部分：MSC分離培養(yǎng)，向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化1. MSC分離培養(yǎng) 切取鼠一側(cè)股骨，暴露骨髓腔，用注射器抽取細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM/20%FBS），反復(fù)多次沖洗出骨髓細(xì)胞，用吸管反復(fù)抽吸后，F(xiàn)icoll 分離液離心分離出有核細(xì)細(xì)胞，移入T75培養(yǎng)瓶，過夜培養(yǎng)，第二日將懸浮細(xì)胞移去（貼壁細(xì)胞為較純的基質(zhì)干細(xì)胞），34天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合時(shí)用胰島素/EDTA（trypsin/EDTA）處理，收獲貼壁細(xì)胞為MSC ( MSC鑒定選用CD29，CD90，CD106等標(biāo)記)。2. MSC向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)在MSC培養(yǎng)液中加入脊索中胚層浸出液，脊索中胚層條件培養(yǎng)液，星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液，多種神經(jīng)生長因子等。3. 鑒定 A. 光鏡及電鏡下觀察轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)改變。B. 免疫組化或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的表面標(biāo)志: nestin, 波形蛋白，RC抗原。第三部分：神經(jīng)干細(xì)胞分離提取，體外培養(yǎng)，基因轉(zhuǎn)染1. 神經(jīng)干細(xì)胞的分離和傳代 分別取鼠紋狀體和孕鼠皮層組織，吸管吹打機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液，利用DMEM/F12(1:1) 加B27及bFGF無血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，具體參見文獻(xiàn)。2. 體外基因轉(zhuǎn)染 對于以上兩種來源的神經(jīng)干細(xì)胞采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將VMYC，EGF，及FGF2 ，PA，MMP cDNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，包括雙基因及單基因轉(zhuǎn)染的多種形式。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCXE由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。E. coli質(zhì)粒DNA大量制備、純化和酶切參照Sambrook等的文獻(xiàn)方法進(jìn)行；按LipofectamineTM試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。第四部分：神經(jīng)干細(xì)胞在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的移植，定向分化及檢測1. 神經(jīng)干細(xì)胞在HD動物模型體內(nèi)移植 按多種組合形式，利用毛細(xì)顯微注射器將經(jīng)多種形式基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞注射到HD無神經(jīng)—53—節(jié)細(xì)胞段；參考文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行， cell/ 。2. 移植后的神經(jīng)干細(xì)胞在HD動物體內(nèi)的分化誘導(dǎo) 維甲酸等分化誘導(dǎo)劑處理，藥物濃度選擇參考文獻(xiàn)。3. 移植后的神經(jīng)干細(xì)胞對HD動物模型無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響檢測 　 A．實(shí)驗(yàn)動物的處理：將實(shí)驗(yàn)組鼠（包括對照組）分別于不同時(shí)期斷頸處死，如移植后4周，16周，32周。取移植處腸組織進(jìn)行檢測，分別按進(jìn)行檢測的項(xiàng)目要求對樣本進(jìn)行處理。Ｂ．光鏡及電鏡檢測移植處組織形態(tài)學(xué)變化。Ｃ．免疫組化技術(shù)：檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性烯醇化酶（NSE），Ｓ100，GAFP等表達(dá)。Ｄ．原位雜交，RTPCR檢測：轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)（VMYC，EGF等），原位雜交所需探針，RTPCR引物可分別購自中山，GIBIC公司，按說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。Ｅ．功能鑒定：直腸測壓技術(shù)，生物化學(xué)方法檢測r氨基丁酸，P物質(zhì)等的合成。4. 神經(jīng)干