創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)書(編輯修改稿)
2024-08-30 01:11 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 外分離和培養(yǎng)將從健康足月分娩產(chǎn)婦采集到的臍帶血(含抗凝劑)緩慢疊加到Ficoll淋巴分離液上，兩者體積比為1:1~2:1。然后，進(jìn)行密度梯度離心(2500rmin1，25 min)，吸取中間白膜層。將吸取到的細(xì)胞用含有10% 胎牛血清的DHank’s平衡鹽溶液離心洗滌兩次(1000 rmin1，5 min)，之后調(diào)整密度接種到培養(yǎng)瓶中備用。 2)臍帶血CD34+細(xì)胞的分離和培養(yǎng)用免疫磁珠篩選分離法（magnetic activated cell sorting, MACS）分選CD34+細(xì)胞。然后將分離出的CD34+細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。在接種到6孔板共培養(yǎng)以前，CD34+細(xì)胞在T形瓶中培養(yǎng)過夜，以適應(yīng)體外生長條件。3）臍帶血CD34+細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)a. 首先進(jìn)行載CD34+細(xì)胞GAC微囊的制備。將已經(jīng)分離的CD34+細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)以使其細(xì)胞數(shù)滿足實(shí)驗(yàn)需求。然后取生長狀態(tài)良好的CD34+細(xì)胞進(jìn)行消化離心，加入明膠溶液(% w/v，溶于DMEM培養(yǎng)基中)使細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2106cellsmL1。在培養(yǎng)箱中孵育30 min，使CD34+細(xì)胞與明膠充分接觸。按海藻酸鈉:明膠=3:1的比例加入海藻酸鈉溶液(% w/v)，混合均勻后，加入到注射器中，此時(shí)細(xì)胞密度為5105 cellsmL1。開動(dòng)微囊制備裝置，在電壓6 kV，流速40 mLh1條件下，滴加1 mL細(xì)胞混合液到30 mL CaCl2( % w/v)溶液中進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，形成載細(xì)胞明膠海藻酸鈉微膠珠。然后將膠珠加到殼聚糖溶液(% w/v)中覆膜反應(yīng)10 min，形成載細(xì)胞GAC微膠囊。用PBS洗滌三次，再用無血清IMEM洗滌一次。b. CD34+細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)。將制備好的微囊加到6孔板的一個(gè)孔中，并添加適量IMEM培養(yǎng)基。共制備6組微囊，分別在常氧(20%氧濃度)培養(yǎng)箱和低氧(5%氧濃度)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每種條件下設(shè)置3組進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。將微囊化CD34+細(xì)胞接種于6孔板中，每孔添加3 mL，平行3孔。低氧組記為a’，常氧組記為
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