第十八章基因診斷與基因治療genediagnosis(編輯修改稿)
2024-08-28 13:28 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 定量的 Mg2+濃度； （ 5） dNTP濃度 PCR一般用 50?200μ mol/L的 dNTP；并且 4種 dNTP濃度應(yīng)相等； 26 （ 6）參數(shù) ① 變性溫度與時(shí)間 一般選擇： 940C， 30秒 ② 退火溫度與時(shí)間 取決于引物長(zhǎng)度 、 濃度 和 G+C含量 ， 一般選擇： Tm 5℃ ③ 延伸溫度與時(shí)間 一般選擇： 70℃ ?75℃ ④ 循環(huán)次數(shù) 取決于模板濃度 ， 一般循環(huán)： 30次 27 PCR操作 各種 PCR反應(yīng)的操作基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列不同，選擇不同的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)。 將 PCR反應(yīng)管置于 DNA自動(dòng)化熱循環(huán)儀上，輸入各種循環(huán)參數(shù)，使 DNA擴(kuò)增在熱循環(huán)儀上很方便地完成。 PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn) 特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，對(duì)樣本質(zhì)量要求不高，能快速、特異地?cái)U(kuò)增任何 DNA片斷。 PCR缺點(diǎn) 由于高靈敏度，使易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。 28 3. PCR產(chǎn)物分析 （ 1） 凝膠電泳分析法 可用瓊脂糖 （ Agrose） 或聚丙烯酰胺 （ PAGE）凝膠電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小 。 同時(shí)應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn) DNA分子量作平行對(duì)照 ， 凝膠中加入溴化乙錠 ， 電泳后 ， 紫外檢測(cè)儀下觀察結(jié)果并拍照 。 （ 在待檢靶序列拷貝數(shù)多 、 且僅擴(kuò)增出一條帶時(shí) ， 用此法即可滿足檢測(cè)要求 。 ） 29 （ 2）點(diǎn)雜交分析法 該法有 2種： ① 將擴(kuò)增產(chǎn)物直接固定在膜上，每一個(gè)探針制備一張膜，然后用不同的特異探針進(jìn)行雜交； ② 將不同的探針固定在膜上，再用有標(biāo)記的 PCR產(chǎn)物 與之雜交。 本法有助于檢測(cè)突變 DNA類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分析。 (當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)多條帶時(shí)，用此法更合適。 ) 30 (三 )基因芯片 將大量序列已知的基因片段以微陣列方式固定在一芯片上做成高密度的點(diǎn)陣排列，與標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，然后用計(jì)算機(jī)分析雜交信號(hào)。 31 (四 ) 基因測(cè)序 即， DNA堿基序列分析，這是最確切、最直接的基因診斷方法。 目前常用的方法為 MaxamGilbert建立的 化學(xué)裂解法 和 Sanger建立的 雙脫氧末端終止法 。 32 四 . 基因診斷的臨床應(yīng)用 (一 ) 遺傳病的基因診斷 (二 ) 腫瘤的基因診斷 (三 ) 感染性疾病的基因診斷 33 舉例： —— 鐮刀狀紅細(xì)胞貧血 β －珠蛋白基因的第六個(gè)密碼子 A→T ↓ 表達(dá)產(chǎn)物： 谷 氨酸 → 纈 氨酸 一個(gè)堿基突變 → 缺失 1個(gè) MstⅡ 內(nèi)切酶 位點(diǎn) 正常人 ： 患者： 34 5’ 3’ 5’ 3’ kb Mst II酶切位點(diǎn) （ CCTNATG） 正常基因 突變基因 1 2 3 正常人 突變攜帶者 患者 35 第二節(jié) 基因治療 基因治療的概念 基因治療的總體策略 基因治療的基本程序 基因治療的現(xiàn)狀與展望 36 一、基因治療概念 狹義概念 用具有正常功能的基因去 置換或增補(bǔ) 患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。 廣義概念 將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的。 37 二、基因治療的總體策略 基因矯正 基因置換 基因增補(bǔ) 基因失活 “ 自殺基因 ” 的應(yīng)用 免疫基因治療 耐藥基因治療 38 （一）基因矯正 （ gene correction） 對(duì)于致病基因中的 異常堿基 進(jìn)行
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