【文章內(nèi)容簡介】 無溶血環(huán)草綠色溶血環(huán)丙鏈甲鏈膽汁溶菌試驗菊糖發(fā)酵試驗奧普托欣試驗小鼠毒力試驗G+矛頭狀成雙排列草綠色溶血環(huán)分離培養(yǎng)G腎形成雙排列生化反應(yīng)鑒別生長血清學(xué)凝集試驗菌落觀察G染色標(biāo) 本（膿汁）直接涂片純培養(yǎng)乙鏈純培養(yǎng)(二)致病性葡萄球菌分離與鑒定直接涂片：G染色觀察形態(tài)、排列及染色性，初報結(jié)果。分離培養(yǎng)：膿汁經(jīng)三區(qū)劃線接種于血平板上，置37℃溫箱培養(yǎng)1824小時，取可疑菌落接種于斜面培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。致病性鑒定：①甘露醇發(fā)酵試驗：取純培養(yǎng)物接種于甘露管中，37℃孵育1824小時后觀察結(jié)果。②血漿凝固酶試驗：采用玻片法。在玻片兩端各滴一滴生理鹽水，取少許純培養(yǎng)物與之混勻成菌液。在一端加入兔血漿一滴混勻，另端不加兔血漿作對照。立即觀察結(jié)果，出現(xiàn)顆粒凝集者為陽性，無凝集者為陰性。結(jié)果判定：根據(jù)上述分離與鑒定結(jié)果綜合判定。實驗八 抗鏈球菌溶血素“O”試驗(Antistreptolysin “O” test)乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生溶解人或家兔紅細(xì)胞的溶血毒素“O”，此毒素具有很強(qiáng)的抗原性，人受溶血性鏈球菌感染后，經(jīng)23周即可產(chǎn)生抗溶血毒素“O”的抗體。此抗體可以中和溶血毒素“O”，此抗體常在病愈后數(shù)月至年余才消失。因此凡檢出病人血清中抗溶血毒至少“O”抗體效價顯著增高時，可以認(rèn)為病人最近受過溶血性鏈球菌感染或反復(fù)受過溶血性鏈球菌的侵害，如風(fēng)濕熱及急性腎小球腎炎等。本試驗簡稱為抗“O”試驗。有間接凝集法和中和法兩種方法。一、抗“O”試驗間接凝集法材料：待檢血清、陽性與陰性控制血清溶血毒素“O”溶液ASO膠乳試劑反應(yīng)板、試管、吸管或加樣器方法：將待檢血清用生理鹽水稀釋成1：50，經(jīng)56℃30分滅活后待用。在反應(yīng)板上分別滴加1：50待檢血清、陽性及陰性控制血清各一滴，再各滴加一滴溶血毒素“O”溶液。輕輕搖2分，充分混勻。各滴加一滴ASO膠乳試劑，20℃室溫下輕搖8分鐘。有清晰凝集者為陽性，反之為陰性。陽性者，再將血清稀釋成1：80，重復(fù)操作，有清晰凝集者為強(qiáng)陽性。結(jié)果判定：強(qiáng)陽性者ASO≥833單位；陽性者ASO≥500單位；陰性者ASO≤250單位。該試驗陽性，可作為風(fēng)濕熱、急性腎小球腎炎等鏈球菌感染有關(guān)疾病的輔助診斷。二、抗“O”試驗_—中和法材料:待檢血清，1％紅血球懸液。溶血素“O”和還原劑（亞硫酸鈉）。生理鹽水、％枸櫞酸鈉鹽水。采血針、小試管、吸管等。方法：％枸櫞酸鈉鹽水中。室溫靜置或離心使血細(xì)胞下沉，上清液即為待檢血清（按1：20計算）。管底的血細(xì)胞再混懸于5毫升生理鹽水，即成為1％紅細(xì)胞懸液。取溶血素“O”及還原劑各一片，置于小試管內(nèi)，加生理鹽水1毫升，用玻璃棒攪碎后，在室溫放置15分鐘，使溶血素“O”恢復(fù)活力。即致活溶血毒素“O”。最后補(bǔ)加鹽水9毫升即可。按下表將患者血清倍量稀釋，并添加致活的溶血素“O”，進(jìn)行實驗。棄去試 劑 1 2 3…………生理鹽水 患者血清（1：20）（ml） 血清稀釋倍數(shù) 1：200 1：400 1：800致活溶血素“O”（ml） 1％細(xì)胞置37℃水浴15分鐘 置37℃水浴45分鐘后觀察結(jié)果結(jié)果：溶血者液體呈鮮紅色，液體澄清，不溶血者液體渾濁。完全不溶血的血清最大稀釋度即為該血清的抗“O”效價。例如溶血的結(jié)果為1：200（）1：400（），1：800（+），則效價為1：400，亦稱為400單位。目前臨床標(biāo)準(zhǔn)是1：200以下為陰性，1：400以上為陽性。實驗九 糞便標(biāo)本中致病性腸道桿菌的 分離鑒定（綜合性實驗）與肥達(dá)氏反應(yīng)(Isolation and identification of pathogenic enterobacteria in stool and widal reaction)腸道桿菌是一群生物學(xué)性狀相似的革蘭氏陰性桿菌。一般以其生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)作為鑒定依據(jù)。腸道桿菌的檢查在檢查水質(zhì)污染，食品衛(wèi)生檢驗及消化感染性疾病的方面均有很大意義。材料：標(biāo)本：病人糞便。培養(yǎng)基：SS瓊脂平板及伊紅美蘭瓊脂平板，半固體雙糖鐵培養(yǎng)基、蛋白胨水，尿素培養(yǎng)基。其它：吲哚試劑，沙門氏菌多價血清，痢疾桿菌多價血清、玻片、生理鹽水等。方法：糞便的細(xì)菌分離和鑒定程序：糞便標(biāo)本增菌培養(yǎng)基SS瓊脂、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基取可疑菌落革蘭氏染色雙糖培養(yǎng)基生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定用分區(qū)劃線法將糞便接種至SS瓊脂平板或伊紅美蘭瓊脂平板上，置37℃溫箱中培養(yǎng)1824小時，取出觀察菌落及供進(jìn)一步試驗用。肥達(dá)氏反應(yīng)肥達(dá)氏反應(yīng)系用已知沙門氏菌抗原測定病人血清未知抗體的凝集試驗，臨床上常用以診斷傷寒病和副傷寒病。材料：標(biāo)本：病人血清（未知抗體）。已知抗原：傷寒“H”及“O”、副傷寒甲及乙的“H”診斷菌液。其他：生理鹽水、大試管、小試管、無菌吸管（1毫升及5毫升）、56℃水浴箱、試管架等。方法：取試管24支。于試管架上排成四排、每排6支，各排之第一管分別標(biāo)明“TO”（傷寒桿菌菌體抗原），“TH”（傷寒桿菌鞭毛抗原）“PAH”（副傷寒桿菌甲鞭毛抗原）“PBH”（副傷寒桿菌乙鞭毛抗原）。使之成1：20稀釋液。取上面稀釋好的血清2毫升。于大試管中剩余的2毫升。稀釋血清中再加入生理鹽水2毫升，混勻后即成1：40稀釋液。取1：40稀釋液2毫升分別加入各排第二管中。如此類推。連續(xù)稀釋血清，分別加入各排的第三管至第五管。第六管不加血清。血清稀釋法見下表：材料鹽水2 ml鹽水2 ml鹽水2 ml鹽水2 ml對照管第一排（TH）第二排（TO）第三排（PA）第四排（PB）血清稀釋 度第一管1：20第二管1：40第三管1：80第四管1：160第五管1：320第六管加入診斷菌液：于第一排各管加入傷寒桿菌“H”。于第二排各管加入傷寒桿菌“O”，于第三排各管加入甲型副傷寒“H”，于第四排各管加入乙型副傷寒“H”，因此各管的血清最后稀釋度為1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。將以上各管在試管架中充分振蕩搖勻后放置56℃水浴中24小時，取置室溫中過夜次日觀察結(jié)果。結(jié)果觀察方法：觀察結(jié)果前不要振搖試管。先觀察抗原對照管應(yīng)無凝集，有時可見管底有圓形沉淀，但輕輕搖試管仍呈均勻混濁現(xiàn)象，如對照管有凝集，即表示抗原或鹽水有問題。試驗管應(yīng)按順序自第一管看起，先不要振搖，將試管舉起，觀察上面液體的清晰程度、及底部有無絮狀凝塊。然后輕搖試管、使凝塊從底部升起，按液體的清濁，凝塊的大小記錄?！癏”抗原凝集成絮狀，疏松的凝塊沉于管底，輕搖即隨之升起，且易打碎；“O”抗原凝集呈顆粒狀，沉于管底，成堅實聚塊，輕搖則不易升起，凝集顆粒較小，不易打碎。凝集的強(qiáng)弱依試管上清液的清晰度與凝集顆 ?；蛐鯛钇拇笮》謩e++++、+++、++、+、－來作判定，其標(biāo)準(zhǔn)如下：上層液體 管 底 凝 塊 判 定澄清透明 大片絮狀或大顆粒 ++++微 混 中等片或顆料 +++微 混 絮片或顆粒較少仍可見 ++混 濁 絮片或顆料似有似無 +混 濁 抗原沉于管底呈圓形塊 －血清稀釋度大，仍可有++凝集者為該血清的效價。解釋結(jié)果時應(yīng)注意以下各點：①病人血清同時與傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌，乙型副傷寒桿菌液發(fā)生凝集時，應(yīng)以效價最高者作為診斷標(biāo)志，低者系類屬凝集反應(yīng)。②凝集效價必須高于正常人的血清，有診斷價值。③雙份血清，第二份血清效價為第一份血清效價的4倍或更高，有確診意義。④應(yīng)結(jié)合患者病史及臨床癥狀，參考“H”與“O”的效價做出正確的判定。正常值：TO1:80 TH1:160 PAH1:80 PBH1:80診斷副傷寒時TO1:40實驗十 糞便中分離細(xì)菌的菌落觀察， 生化反應(yīng)與血清學(xué)試驗（綜合性實驗）Observation of isolation bacterium colony in stool、biochemical relation and serologic test一、菌落觀察在SS瓊脂和E、M、B瓊脂培養(yǎng)基上，如檢查的沙門氏菌或痢疾桿菌，則選取平板上無色半透明光滑濕潤邊緣整齊的圓形菌落。而非致病菌，如大腸桿菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上則是紅色的菌落，在EMB培養(yǎng)基上則是紫黑色并帶有金屬光澤的菌落。二、生化反應(yīng)與其結(jié)果的觀察在培養(yǎng)基上選擇無色半透明較小的可疑菌落，取單個可疑菌落的一半接種半固體雙糖培養(yǎng)基（每一種標(biāo)本應(yīng)挑選23個可疑菌落分別接種雙糖培養(yǎng)基23管），放37℃培養(yǎng)1824小時。并在菌落的另一半作革蘭氏染色觀察是否為革蘭氏陰性桿菌。(一) 糖發(fā)酵糖發(fā)酵試驗中細(xì)菌是否分解某些糖類，以及分解的情況。試驗常用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖五種糖發(fā)酵管，管上分別以紅、黃、蘭、白、黑色標(biāo)記。方法：將細(xì)菌接種于微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)1824小時，觀察結(jié)果。必要時可培養(yǎng)更長時間再判定結(jié)果。結(jié)果觀察：首先觀察細(xì)菌是否生長，然后記錄糖發(fā)酵情況。細(xì)菌生長，指示劑變色，表明發(fā)酵該種 糖產(chǎn)酸，記錄符號為“+”；細(xì)菌生長，指示劑變色，微量管中有氣泡，表明發(fā)酵該種糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，記錄為 “”；細(xì)菌生長，指示劑不變色，表示細(xì)菌不分解該種糖，記錄為“”。(二) IMViC試驗靛基質(zhì)（I）、甲基紅(m)、V－P（Vi）及枸櫞酸鹽利用（C）四種試驗，常用于鑒定腸道桿菌，合稱為IMViC試驗。靛基質(zhì)試驗（Indole test）檢查細(xì)菌是否分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。方法：將細(xì)菌接種于蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)1824小時，（或更長）。結(jié)果觀察:滴加數(shù)滴柯氏試劑于培養(yǎng)基表面，輕輕搖動試管，如試劑變?yōu)榧t色則為陽性，記錄為“+”；若試劑呈黃色則為陰性，記錄為“”。甲基紅試驗（Methyl red test），前者分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，不轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴＜谆状迹逝囵B(yǎng)液酸性較強(qiáng)，；后者分解葡萄糖產(chǎn)生的丙酮酸脫羧，生成中性乙酰甲基甲醇，培養(yǎng)液pH較高。方法：將細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)48小時。結(jié)果觀察：滴加甲基紅試劑35滴。蛋白胨水呈紅色，記錄為“+”；，記錄為“”。VP試驗（VogesProskauer test）。方法：將細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)48小時。觀察結(jié)果于培養(yǎng)基中滴加等量的40％KOH溶液（％肌酸），培養(yǎng)液變成紅色表示試驗為陽性，記錄為“+”，培養(yǎng)液不變色表示試驗為陰性，記錄“”。產(chǎn)氣桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，在堿性溶液中被空氣中的氧所氧化，生成二乙酰，二乙酰再與培養(yǎng)基中的胍基化合物發(fā)生反應(yīng)，生成紅色化合為陽性，記錄為“+”；，為陰性，記錄為“”。枸櫞酸鹽利用試驗（Utilization of citrate）。方法：將細(xì)菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時。結(jié)果觀察：某些細(xì)菌（如產(chǎn)氣桿菌）能利用枸櫞酸鹽作為碳源，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中指示劑BTB由淺綠色轉(zhuǎn)為深藍(lán)色，為枸櫞酸鹽利用試驗陽性，記錄為“+”，培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記錄為“”。(三) 硫化氫產(chǎn)生試驗（Production of H2S）檢查細(xì)菌能否分解胱氨酸等含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫。硫化氫遇醋酸鉛或硫酸亞鐵，形成黑褐色的沉淀物。方法：將細(xì)菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1824小時。結(jié)果觀察：如沿穿刺線呈黑褐色則為陽性，記錄為“+”；若無變化，則為陰性，記錄為“”。(四) 純培養(yǎng)：將經(jīng)初步鑒定的菌落其余部分、進(jìn)行雙糖培養(yǎng)基接種、37℃培養(yǎng)1824小時后，按表10初步定為何種菌。大腸、埃希氏菌、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬雙糖培養(yǎng)結(jié)果 葡萄糖 乳 糖 動 力大