【文章內(nèi)容簡介】 于標記羧酸的熒光試劑為磺酸酐類化合物，這類試劑通常需要冠醚和氫氧化鉀的存在，并要使用有毒的苯和甲苯作溶劑，且色譜分離前需要對衍生化試劑進行處理，既費時又費力。還有一種用于標記熒光類化合物的熒光試劑是苯并酰肼類，該類試劑無需任何催化劑即可在常溫條件下與羧酸類化合物進行反應。然而，該類試劑用于C1—C20脂肪酸的衍生化并同時分離分析較困難。所以并不能說一種衍生試劑可以適用于任何一種反應。接著讓我們來看一看羧酸的衍生化實質(zhì)過程。下面羧酸的熒光衍生劑在研究羧酸的熒光衍生試劑時，當羧酸的羰基是衍生反應基團時，(H2N—NH)可與羰基縮合。還有一些衍生試劑的反應基團是于羰基的—OH基團反應，這些反應基團有：溴甲基(CH2Br)，重碳甲烷基(CHN2)碳二酰二胺(NCN)，氨基（NH2）等。給這些反應基團接上熒光團，就構(gòu)成了羧酸的各種熒光試劑，它們與羧酸的反應過程見下圖。[5] 熒光試劑與羧酸的反應示意圖 高效液相色譜及特點高效液相色譜法(HPLC)自20世紀60年代崛起，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展在理論和實踐方面都日趨完善，并逐漸成為一門新生代，高技術(shù)含量的學科，應用范圍已經(jīng)涉及醫(yī)藥，環(huán)保，生命科學，石油化工等幾乎所有基礎及應用研究領域。［31］色譜是這樣一個過程，即某一混合物中各組分在被稱之為固定相和流動相、的兩相之間因具有不同的分配系數(shù)而進行的分離，所以當此混合物在從固定床層的一端加入，并隨流動相向前流動的過程中，各組分在兩相間經(jīng)過反復多次的分配，結(jié)果導致在固定相上有不同的保留而被分離，分配系數(shù)大的，保留時間長，分配系數(shù)小的，保留時間短。[31]高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)除了叫高壓或高速色譜外，又稱為高分離度液相色譜或近代柱液相色譜，但一般人們都用第一個術(shù)語，即高效液相色譜。它同其他經(jīng)典液相色譜和氣相色譜相比較，可以看出高效液相色譜具有分離效能高，分析速度快，檢測靈敏度高和應用范圍廣泛的特點，特別適合高沸點，大分子，強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離和分析。單元部件1. 輸液泵泵是一項高效液相設備中最重要的單元部件，是驅(qū)動溶劑和樣品通過色譜柱和檢測系統(tǒng)的高壓源，其性能好壞直接影響整個儀器和分析結(jié)果的可靠性。用于分析目的的泵應當流量穩(wěn)定，耐高壓，能耐各種流動相，如有機溶劑，水和緩沖液。目前，商品高效液相色譜儀普遍采用體積小，方便多用的往復泵和隔膜泵。以往復泵為例，又有單，雙和三泵頭結(jié)構(gòu)之分。顯然，在單泵頭的情況下，如果沒有必要的補償機構(gòu)，脈動較大，若改為雙泵頭時、或三泵頭，交替動作的柱塞分別以1800和1200的相位差排液和吸液，則輸出流向的脈動大為改善。因而后兩種往復泵更受歡迎。對于分析極性范圍寬或分子體積相差較大的復雜混合物，為了能在較短的時間內(nèi)對所有各組分均實現(xiàn)滿意的分離，常采用梯度淋洗操作。這時需要使用兩臺泵，按一定的程序逐步增加混合溶劑中的極性成分，以提高單位時間內(nèi)的峰容量。用于鋼性微粒柱裝柱的高壓泵多是氣動泵和往復泵，主要恒量指標是能產(chǎn)生高壓的和較大排液量的。這是自行裝柱的實驗室所必需的設備。2. 色譜柱人們長說色譜柱是色譜儀的心臟，因為色譜的核心問題分離，是在這里進行的。在色譜發(fā)展史上，色譜柱填料與柱技術(shù)的發(fā)展一直是色譜工作者共同關(guān)心的問題，可以說，液相色譜的每一個重大發(fā)展都和色譜柱的每一次突破密切相關(guān)。為適應不同的分離分析要求?？捎胁煌闹?，內(nèi)裝不同性質(zhì)的填料。最長使用的色譜柱是10~30CM長，2~5MM內(nèi)徑的內(nèi)壁拋光的不銹鋼管柱，內(nèi)裝5~10um高效微粒固定相，采用高壓均漿裝柱技術(shù)填充。相同柱長的效率遠遠高于氣相色譜，以2MM內(nèi)徑柱為例，250CM長的5微米YWG硅膠柱柱效可達20000理論塔板，而5微米YQGGH反相鍵合相柱可達14000理論塔板。高效柱的填充需要特殊的設備和技術(shù)。國際上各色譜儀的色譜產(chǎn)品廠家均提供預裝柱。3. 進樣器待分析樣品從柱頭進樣器引入的方式可分為注射器進樣，停流進樣，閥進樣和自動進樣器進樣四種，其中注射器和閥進樣為最長用。在10MPA以下的進口壓力可用1~10ul的微量注射器進樣，在這種情況下一般可以獲得最高的柱效率，但進樣重復性不佳，特別是在較高壓力下閥進樣是比較理想的，進樣體積可變，也可以固定，但一般來說，柱效受些影響。自動進樣器適合與多樣品重復操作，便于用微處理機控制，實現(xiàn)自動化。4 檢測器 被分析組分在柱流出液中濃度的變化可以通過檢測器轉(zhuǎn)化為光學的或電學的信號被檢出，是色譜儀的“眼睛”。檢測器性能的好壞直接關(guān)系到定性定量分析結(jié)果的可靠性。在高效液相色譜中最常用的檢測器是光學檢測器，例如視差折光，紫外吸收或分光光度檢測器。前者是通用型的檢測器，但靈敏度較低，適合于常量分析；后者中，紫外吸收有比較高的靈敏度，但只能檢處在儀器特定波長下有吸收的化合物。紫外可見分光光度檢測器可適用較寬的范圍可以彌補單波長吸收檢測器選擇性太強的缺陷，因而是一種應用面較廣的高效液相色譜檢測器。近年來發(fā)展的二極管陣列檢測器允許對柱流出物進行不停留的瞬間波長快速掃描，通過微處理機控制獲得光吸收，波長和時間的三維色譜/光譜圖，從而取得更多的定性色譜峰純度鑒定的信息，是一種比較理想的檢測器。熒光檢測器有較高的靈敏度，一般說來可比紫外吸收高10~1000倍，但也有更專一的選擇性。對于一般電活性物質(zhì)（如無機物質(zhì)，有機酸，堿和兩性離子），電化學檢測器的靈敏度可比紫外吸收高2~3個數(shù)量級。但總的來說，高效液相色譜的檢測器目前尚不理想，靈敏度不及氣相色譜。發(fā)展通用，靈敏和更專一的檢測器是今后應探索的重要課題。5 餾分收集器如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它的色譜鑒定，或獲取少量實驗樣品的小型制備，餾分收集是必要的。用小試管收集，手工操作只適合于少數(shù)幾個餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯。餾分收集器比較理想，因為便于用微處理機控制，按預先規(guī)定好的程序，或按時間，或按色譜峰的起落信號逐一收集和重復多次收集。6數(shù)據(jù)獲取和處理系統(tǒng)把檢測器的信號顯示出來的數(shù)據(jù)系統(tǒng)可以有多種形式。最簡單的是電位差式長圖記錄器，記錄信號隨時間的變化，得到色譜流出曲線或色譜圖。面對定性定量較有利的是采用積分儀，記錄保留時間或峰號，以及峰面積。先進的高效液相色譜儀多用微處理機控制，這通常是一臺專用的微機算機。其功能有二，一是作為數(shù)據(jù)處理機，例如輸入定量校正因子，按預先選定的定量方法，將面積積分數(shù)換成實際的成分分析結(jié)果，或者給出某些色譜參數(shù)；二是作為控制機，控制整個儀器的運轉(zhuǎn)，例如按預先編好的程序控制沖洗劑的選擇，梯度淋洗，流速，柱溫，檢測波長，進樣和數(shù)據(jù)處理。所有指令和數(shù)據(jù)通過鍵盤輸入，結(jié)果在陰極射線管或繪圖打印機上顯示出來。更新一代的色譜儀應當具有某些人工智能的特點，即能根據(jù)以有的規(guī)律自動選擇操作條件，根據(jù)規(guī)律和以知的數(shù)據(jù)，信息，進行判斷，給出定性定量結(jié)果。[8] 什么是膽汁酸?膽汁酸由人體肝臟（實質(zhì)）細胞中的膽固醇合成，儲存在膽囊中，分泌到小腸，被回腸最接近的有效地再吸收，并經(jīng)過門靜脈返回肝臟。膽汁酸在排泄體內(nèi)膽固醇及腸道中類脂類的增溶及吸收方面具有重要