transwell實(shí)驗(yàn)原理與步驟(編輯修改稿)
2025-07-22 07:32 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 野帶有很大的偶然性，也會(huì)摻進(jìn)人為影響，特別是計(jì)數(shù)視野較少的時(shí)候。我選取16個(gè)視野，不是隨機(jī)選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。不同廠家不同型號(hào)的小室，膜的面積不盡相同，但個(gè)人認(rèn)為，拍照時(shí)還是應(yīng)當(dāng)選取固定的位置，并選擇盡可能多的視野。（2）“非貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)由于某些細(xì)胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時(shí)細(xì)胞在穿過(guò)膜后不能附著在膜上，而是掉進(jìn)下室。這種情況我沒(méi)有遇到過(guò)，根據(jù)論壇里提供的經(jīng)驗(yàn)，可以收集下層培養(yǎng)液，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞量，也可用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法直接在鏡下計(jì)數(shù)，個(gè)人認(rèn)為MTT應(yīng)該也是可以用的，有興趣的可以試試看。2. 間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法主要用于穿過(guò)細(xì)胞過(guò)多，而無(wú)法通過(guò)計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實(shí)驗(yàn)是同樣的原理。（1）MTT法① 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞② 24孔板中加入500 mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在培養(yǎng)基中，37 ℃ 4 h后取出。③ 24孔板中加入500 181。l DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在DMSO中，振蕩10 min，使甲?充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上測(cè)OD值。（2）熒光試劑檢測(cè)這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細(xì)胞，再將細(xì)胞裂解，檢測(cè)熒光值。Chemicon的ECM554即屬于這類。（3）結(jié)晶紫檢測(cè)上文已說(shuō)過(guò)，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結(jié)晶紫染色還有個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是染色和脫色的過(guò)程并不影響膜上細(xì)胞，在脫色后還可重新染色。1. 1Matrigel：Becton Dickinson Compary, 20 ℃保存；Tanswell plate：Costar ,USA , 3422 ,聚碳酯膜微孔直徑為8μm；蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。1. 2 趨化因子的制備 取傳代第二天長(zhǎng)勢(shì)良好的NIH3T3細(xì)胞,無(wú)血清培養(yǎng)基輕柔漂洗兩次。 加入無(wú)血清培養(yǎng)基,37℃,5 %CO2 培養(yǎng)24 h～48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；4 ℃,12 000rpm 離心,10 min ,取上清； μm 濾膜過(guò)濾除菌；分裝,在 20 ℃保存。1. 3transwell 培養(yǎng)板準(zhǔn)備 所有操作均需無(wú)菌操作。20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃過(guò)夜融化。在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取100μl Matrigel 加入冰預(yù)冷的300μl 無(wú)血清培養(yǎng)基中,充分混均。取上述稀釋的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆蓋整個(gè)聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成膠。已鋪好
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