免疫共沉淀步驟(編輯修改稿)
2025-07-21 22:34 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 或者60mm dish為單位的；不否認某些蛋白或復合體確實可以在如此苛刻的條件下完成coIP。但是，更多的時候不是這樣子的。以我自己研究的復合體為例，其內(nèi)源性IP最低起始細胞數(shù)是4050% confluence的145mm dish；比這個數(shù)目更低，實驗結(jié)果就很不穩(wěn)定甚至無信號。當某些藥品、試劑非常昂貴時，鄙人才會勉為其難。否則，一律2 dishes 100% confluence，可以elute成30ul跑兩次；相互作用微弱時，15ul僅跑一次；再弱，多養(yǎng)幾塊板（CE增加抗體和beads仍可保持不變，因此只浪費培養(yǎng)基總比浪費一個冗長的時間走麥城要好）。后續(xù)若為質(zhì)譜分析，需考慮小規(guī)模量產(chǎn)。二、IP前的準備工作：coIP:分為內(nèi)源性蛋白的相互作用和非內(nèi)源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之間以及外源拖內(nèi)源蛋白）。非內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要是通過過表達來實現(xiàn)，通常為簡化實驗、提高IP效率會讓外源蛋白帶上標簽（tagged；這也是沒有相應的可用于IP的內(nèi)源蛋白抗體之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。有些人喜歡用Histagged蛋白然后進行coIP，實際上它存在潛在的隱患。當初鄙人用Sigma aHis（鼠單抗；免費廣告）WB外源蛋白發(fā)現(xiàn)CE里面一塌糊涂（帶型漂亮就是非常多的帶），那時候還抱怨這個抗體特異性不好。后來，當了解到很多蛋白會有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因為效價非常好，所以很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識別。同理，如果用NiNTA beads去PD Histagged的蛋白，完全有可能PD那些內(nèi)源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而這樣的蛋白還非常多。那么，當初開發(fā)His tag的主要目的，個人認為主要是可以用廉價的化學試劑洗脫，且NiNTA beads這類非抗體類的beads成本低廉，可大量工業(yè)生產(chǎn)。因此，用這個tag去生產(chǎn)有活性的蛋白是首選。tandem tag實際上從成本角度和His tag差不多，洗脫試劑價格低廉，因此可用于大規(guī)模PD之后的質(zhì)譜分析，能獲取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含鈣調(diào)蛋白相互作用domain，天然會結(jié)合鈣信號相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號蛋白之間的相互作用，有一定的應用局限。當然，筆者不太清楚近年來該方法有無改進，但正是由于引入鈣調(diào)domain才實現(xiàn)了降低成本的目的，因此猜測可能性不大。、HA、Flagtagged：Myc仍然會有天然的干擾，應用略有局限；相較后兩者是人工合成專門用于tagged蛋白（有相應的專利，因此目前無論抗體或交聯(lián)好的beads價格都非常昂貴），因此干擾最小、最常用。如需進一步細致區(qū)分，aFlag效價比aHA略高，因此更適合IP。當然，公司仍在努力尋找效價更好的aHA以及IP HA的抗體（Flag系Sigma專利，因此目前只能忍受其過高的定價）。那么，之前頗流行的aHA鼠源單抗（其clone名稱為12CA5）為何被潛在地摒棄了？原因大概是：該克隆株可以輕易獲取，流傳甚廣，因此可以取腹水自制；效價不高，特異性很差。尤其是特異性的問題，用該抗體去交聯(lián)的beads做coIP，隱患很大（可以輕易PD非常濃的非特異性蛋白）——因此，購買商品化aHA beads時，請仔細閱讀產(chǎn)品說明（避開12CA5系列）。還有GST等等，不一一列舉了。將tag構(gòu)建到蛋白的N端還是C端，也是一個潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號肽，如果將tag構(gòu)建到N端，則外泌時會被信號肽酶連同信號肽一起切除；所以這時必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白的C端是疏水區(qū)，有的時候?qū)ag構(gòu)建在C端會影響蛋白原來的空間結(jié)構(gòu)，如恰好C端同時是相互作用的結(jié)構(gòu)域，某些時候還可能被遮蔽，從而干擾相互作用。因此，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時候是N端、C端tagged同時分別構(gòu)建，以備萬一。內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要依靠抗體IP，WB或者質(zhì)譜分析。另外一條途徑，是用外源性蛋白的coIP指代內(nèi)源性蛋白，上文提到的tandemtag技術(shù)的目的就是為了實現(xiàn)這種可能。它的核心是將外源性蛋白的過表達降低極低水平用于模擬體內(nèi)環(huán)境。實際上，在構(gòu)建外源過表達體系的時候，通常可以得到一系列表達水平差異的穩(wěn)定單克隆，可以通過進一步篩選獲得外源與內(nèi)源相加與原內(nèi)
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