免疫共沉淀步驟(編輯修改稿)
2025-07-21 22:34 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 或者60mm dish為單位的；不否認(rèn)某些蛋白或復(fù)合體確實(shí)可以在如此苛刻的條件下完成coIP。但是，更多的時(shí)候不是這樣子的。以我自己研究的復(fù)合體為例，其內(nèi)源性IP最低起始細(xì)胞數(shù)是4050% confluence的145mm dish；比這個(gè)數(shù)目更低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就很不穩(wěn)定甚至無(wú)信號(hào)。當(dāng)某些藥品、試劑非常昂貴時(shí)，鄙人才會(huì)勉為其難。否則，一律2 dishes 100% confluence，可以elute成30ul跑兩次；相互作用微弱時(shí)，15ul僅跑一次；再弱，多養(yǎng)幾塊板（CE增加抗體和beads仍可保持不變，因此只浪費(fèi)培養(yǎng)基總比浪費(fèi)一個(gè)冗長(zhǎng)的時(shí)間走麥城要好）。后續(xù)若為質(zhì)譜分析，需考慮小規(guī)模量產(chǎn)。二、IP前的準(zhǔn)備工作：coIP:分為內(nèi)源性蛋白的相互作用和非內(nèi)源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之間以及外源拖內(nèi)源蛋白）。非內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要是通過(guò)過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，通常為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)、提高IP效率會(huì)讓外源蛋白帶上標(biāo)簽（tagged；這也是沒(méi)有相應(yīng)的可用于IP的內(nèi)源蛋白抗體之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。有些人喜歡用Histagged蛋白然后進(jìn)行coIP，實(shí)際上它存在潛在的隱患。當(dāng)初鄙人用Sigma aHis（鼠單抗；免費(fèi)廣告）WB外源蛋白發(fā)現(xiàn)CE里面一塌糊涂（帶型漂亮就是非常多的帶），那時(shí)候還抱怨這個(gè)抗體特異性不好。后來(lái)，當(dāng)了解到很多蛋白會(huì)有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因?yàn)樾r(jià)非常好，所以很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識(shí)別。同理，如果用NiNTA beads去PD Histagged的蛋白，完全有可能PD那些內(nèi)源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而這樣的蛋白還非常多。那么，當(dāng)初開(kāi)發(fā)His tag的主要目的，個(gè)人認(rèn)為主要是可以用廉價(jià)的化學(xué)試劑洗脫，且NiNTA beads這類(lèi)非抗體類(lèi)的beads成本低廉，可大量工業(yè)生產(chǎn)。因此，用這個(gè)tag去生產(chǎn)有活性的蛋白是首選。tandem tag實(shí)際上從成本角度和His tag差不多，洗脫試劑價(jià)格低廉，因此可用于大規(guī)模PD之后的質(zhì)譜分析，能獲取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含鈣調(diào)蛋白相互作用domain，天然會(huì)結(jié)合鈣信號(hào)相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號(hào)蛋白之間的相互作用，有一定的應(yīng)用局限。當(dāng)然，筆者不太清楚近年來(lái)該方法有無(wú)改進(jìn)，但正是由于引入鈣調(diào)domain才實(shí)現(xiàn)了降低成本的目的，因此猜測(cè)可能性不大。、HA、Flagtagged：Myc仍然會(huì)有天然的干擾，應(yīng)用略有局限；相較后兩者是人工合成專(zhuān)門(mén)用于tagged蛋白（有相應(yīng)的專(zhuān)利，因此目前無(wú)論抗體或交聯(lián)好的beads價(jià)格都非常昂貴），因此干擾最小、最常用。如需進(jìn)一步細(xì)致區(qū)分，aFlag效價(jià)比aHA略高，因此更適合IP。當(dāng)然，公司仍在努力尋找效價(jià)更好的aHA以及IP HA的抗體（Flag系Sigma專(zhuān)利，因此目前只能忍受其過(guò)高的定價(jià)）。那么，之前頗流行的aHA鼠源單抗（其clone名稱(chēng)為12CA5）為何被潛在地摒棄了？原因大概是：該克隆株可以輕易獲取，流傳甚廣，因此可以取腹水自制；效價(jià)不高，特異性很差。尤其是特異性的問(wèn)題，用該抗體去交聯(lián)的beads做coIP，隱患很大（可以輕易PD非常濃的非特異性蛋白）——因此，購(gòu)買(mǎi)商品化aHA beads時(shí)，請(qǐng)仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明（避開(kāi)12CA5系列）。還有GST等等，不一一列舉了。將tag構(gòu)建到蛋白的N端還是C端，也是一個(gè)潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號(hào)肽，如果將tag構(gòu)建到N端，則外泌時(shí)會(huì)被信號(hào)肽酶連同信號(hào)肽一起切除；所以這時(shí)必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白的C端是疏水區(qū)，有的時(shí)候?qū)ag構(gòu)建在C端會(huì)影響蛋白原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)，如恰好C端同時(shí)是相互作用的結(jié)構(gòu)域，某些時(shí)候還可能被遮蔽，從而干擾相互作用。因此，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時(shí)候是N端、C端tagged同時(shí)分別構(gòu)建，以備萬(wàn)一。內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要依靠抗體IP，WB或者質(zhì)譜分析。另外一條途徑，是用外源性蛋白的coIP指代內(nèi)源性蛋白，上文提到的tandemtag技術(shù)的目的就是為了實(shí)現(xiàn)這種可能。它的核心是將外源性蛋白的過(guò)表達(dá)降低極低水平用于模擬體內(nèi)環(huán)境。實(shí)際上，在構(gòu)建外源過(guò)表達(dá)體系的時(shí)候，通常可以得到一系列表達(dá)水平差異的穩(wěn)定單克隆，可以通過(guò)進(jìn)一步篩選獲得外源與內(nèi)源相加與原內(nèi)
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