【文章內(nèi)容簡介】 用肉汁胨斜面菌苔為菌種，接種環(huán)接種后用凡士林油封管，同時也要以封油的不含硝酸鉀的培養(yǎng)基做對照。培養(yǎng) 1～7d，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氨氣，是陽性反應(yīng)；如不含硝酸鉀的對照培養(yǎng)基也產(chǎn)生氣泡則只能按可疑或陰性處理，不產(chǎn)生氣泡為陰性。 硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基配方：肉汁胨培養(yǎng)液 100ml， KNO3 lg，每管分裝 45ml試劑：(1)格里斯氏試劑 (2)二苯胺試劑將測定菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，置適溫培養(yǎng) 5d。每株菌做 3 個重復(fù)，另留兩管不接種作對照。在兩支干凈的空試管中倒入少許培養(yǎng) 5d 的培養(yǎng)液，再各加一滴 A 液及 B 液，在對照管中同樣加入 A 液，B 液各一滴。結(jié)果觀察：當培養(yǎng)液中滴入 A、B 液后，溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰色、橙色、棕色等表示亞硝酸鹽存在，為硝酸7 / 29鹽還原陽性。如無紅色出現(xiàn)，則可加入一、二滴二苯胺試劑，此時如呈藍色反應(yīng)，則表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽，又無亞硝酸鹽反應(yīng)，表示無硝酸鹽還原作用：如不呈藍色反應(yīng)，表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已還原成其它物質(zhì)，故仍按硝酸鹽還原陽性處理。 碳源的利用培養(yǎng)基：(NH 4)2SO4 ，NaH 2PO4 ? H2O ，K 2HPO4 ，MgSO 4 ? 7H2O ，CaCl 2 ? 2H2O ，蒸餾水 1000ml，含碳化合物 ％，pH 177。用菌體懸液，每一個測定菌都須接種未加合碳化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。適溫培養(yǎng) 14 天觀察。凡測定菌在合有碳水化合物培養(yǎng)基中的生長情況明顯超過空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長情況者為陽性。否則為陰性。如兩種培養(yǎng)基上的生長情況差別不明顯，可在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種三次。如生長差別仍不明顯，則按陰性處理。 卵磷脂酶測定培養(yǎng)基：無菌條件下取卵黃加等量的生理鹽水，搖勻后，取 10ml 上述懸液加入到融化的、約 5055℃的 200ml 牛肉膏蛋白胨中，混合均勻后倒人培養(yǎng)皿內(nèi)。制成的卵黃平板過夜后即可使用。取 1824h 的斜面或培養(yǎng)液中的菌體點種在上述平板上。在菌落四周圍和下面有不透明的區(qū)出現(xiàn)，表示卵磷脂分解生成脂肪，說明有卵磷脂酶。 精氨酸雙水解反應(yīng)培養(yǎng)基：蛋白胨 1g，酚紅 ，牛肉膏 5g，L精氨酸鹽 10g，K 2HP04 ，蒸餾水 1000ml，瓊脂 6g，分裝試管，高度約 45cm。用幼齡菌種穿刺接種，并用凡士林油封管，適溫培養(yǎng) 14 天觀察。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為紅色者為陽性，應(yīng)有不含精氨酸空自做對照。 運動性的檢查半固體瓊脂穿刺法。用直引穿刺接種試驗菌于半固體培養(yǎng)基內(nèi)，于適溫培養(yǎng)。細菌的運動性可用透過光目測。如生良物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示試驗菌無運動性。如生長物由穿刺線向四周呈云霧狀擴放，其邊緣呈云霧狀，則表示試驗菌株8 / 29有運動性。對生長快的細菌應(yīng)培養(yǎng)一天后觀察。如第一第不能判定可在第 2—3 天再觀察。如 2—3 天時仍不能明確判定是否有運動性，可延遲到 5—6 天再觀察一次。因為游動力弱的細菌，在半固體培養(yǎng)基中第 12 天中尚不能從穿刺線游開，故需多培養(yǎng)幾天觀察。如實驗菌在半固體培養(yǎng)基中產(chǎn)氣，氣泡將穿刺線上的生長物擠亂。此時應(yīng)注意生長物的擴散情況，不可誤將不運動的細菌判為有運動性。如試驗菌品好癢細菌．穿刺線上生長物很少，可檢查從培養(yǎng)基表面向下滲入的生長物的情況。 16S rDNA 序列提取及測序委托寶生物工程（大連）有限公司測序 變性在培養(yǎng)基中挑取菌體于 50ul TaKaRa Lysis Buffer for Microanism to Direct PCR(Code )中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件： 80℃，15 min PCR 擴增使用 TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code ） ，進行 PCR擴增目的片段。反應(yīng)條件：94℃ 5 min 1 cycle 30 cycles????℃℃℃72℃ 5 min 1 cycle反應(yīng)體系:上述 1 的變性反應(yīng)液 1 ulPCR Premix 25 ulForward primer(20pmol/ul) Reverse primer2(20pmol/ul) 16Sfree H2O 23ul9 / 29Total 50ul取 5 ul 進行 3%瓊脂糖凝膠電泳使用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit （Code No. D823A）切膠回收目的片段進行 DNA 測序。 測序以 Seq Forward、Seq Internal 和 Seq Reverse 為引物進行 DNA 測序。 抑菌劑的篩選 細菌鑒定系統(tǒng)試劑卡藥敏鑒定 使用細菌鑒定系統(tǒng)中的藥敏試劑卡對病害菌進行多種抗生素的抑菌實驗。取適量待檢菌株置于藥敏培養(yǎng)液中，用無菌加樣滴管取藥敏試驗菌液加入藥敏試驗孔中，每孔加試驗菌液 150μl。蓋上卡片蓋板，將卡片置于 35℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 1624h 后，取出卡片，即可人工目測結(jié)果。 常用抗生素抗性試驗采用濾紙片法，以抑菌圈的大小，測定殺菌效果。本試驗采用紙碟法：取 用平板涂布法將菌混勻密布于生長培養(yǎng)基的平板，同時以無菌鑷子取含抗生素的紙片于含菌平板上，置 30℃培養(yǎng) 2448h 后，取出觀察抑菌圈大小。讀取結(jié)果，以所測抑菌圈的平均直徑(mm) 來表示藥劑對細菌的抑菌力。(05mm)無作用，(615mm) 弱作用，(15mm)強抑制作用 [14]。10 / 293．結(jié)果與分析 污染杏鮑菇樣本的性狀描述 圖 1 菌絲包和菇體樣本污染圖 The sample figure of pollution during mycelial and fruiting bodies growth 從圖 1 可以看出，污染杏鮑菇的樣本在菌絲生長階段，在料袋上出現(xiàn)零星的黃色水珠，黏度不大，這一現(xiàn)象導(dǎo)致菌絲長滿袋的時間延長 57d；且這現(xiàn)象一般出現(xiàn)在袋口附近，緩慢向下蔓延至整個料包的 1/4 為止。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的料包在菌絲長滿之后進入出菇環(huán)節(jié)，經(jīng)過正常的消毒環(huán)節(jié)后，會長出子實體，但隨著子實體的增大，菇體會出現(xiàn)大量黃色粘稠狀水珠，隨著培養(yǎng)時間的延長，被污染的菇體最終會腐爛，而與之接觸的健康菇體也會被感染出現(xiàn)相同的癥狀。在菌絲生長階段，若在無菌條件下去除黃色水珠，會大幅度降低后期菇體的污染情況以及推遲出現(xiàn)黃色粘稠液體的時間。因此斷定，菌絲生長階段出現(xiàn)的黃色水珠與后期在子實體上的黃色液體為同一菌株的胞外分泌物。 污染病原菌的分離 分別挑去菌絲料包上的水珠和污染菇體，進行涂布培養(yǎng)。結(jié)果表明，兩個樣本的培養(yǎng)結(jié)果類似，均出現(xiàn)了兩種細菌，證實了這一污染現(xiàn)象是由兩種微生物引起，分別為 CTE 722B 和 CTE 722C；只是兩者比例有差異，前者 CTE 722C 較多，CTE722B 較少，后者則反之。在培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，CTE722B 為半透明、淡黃色的圓形菌落，表面隆起，邊緣略粗糙；CTE722C 為半透明、乳白色的圓形菌落，邊緣整齊光滑；CTE722B 的菌落直徑較 CTE722C 的大。11 / 29圖 2 涂布培養(yǎng)結(jié)果 The result of polluted sample coated culture 病原菌的固體培養(yǎng)特征2 個菌株在牛肉膏蛋白胨平板上生長 24h 后，觀察其形態(tài)特征見表 表 菌株 SS2 在 4 種固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征比較菌株培養(yǎng)基S1 S2營養(yǎng)瓊脂 菌落圓形，半透明，乳白色，表面多皺，隆起，邊緣略粗糙菌落圓形，半透明，乳白色，邊緣整齊，光滑發(fā)亮LB 瓊脂 菌落圓形，半透明，杏仁白色，表面光滑濕潤，平坦，邊緣平整菌落圓形，半透明，乳白色，表面光滑濕潤，平坦，邊緣平整金氏等 A 培養(yǎng)基 無水溶性產(chǎn)生 無水溶性產(chǎn)生金氏等 B 培養(yǎng)基 無非水溶性色素產(chǎn)生 無非水溶性色素產(chǎn)生 病原菌的個體形態(tài)特征通過普通光學(xué)顯微鏡對菌株 SS2 的菌體形態(tài)進行觀察，結(jié)果（見表 、圖、圖 、圖 ）表 菌株 SS2 個體形態(tài)的比較菌株染色方法S1 S2革蘭氏染色 革蘭氏陰性，短桿狀 革蘭氏陰性，短桿狀，近似球狀CTE 722BCTE 722C12 / 29芽孢染色 無芽孢 無芽孢圖 菌株 S1 的芽孢染色結(jié)果 16S rDNA 序列分析為進一步確定菌株的分類位置，對其 16S rDNA 序列進行了分析，結(jié)果見表下表 菌株 S1 的 16S rDNA 序列分析表 菌株 S1 的 16S rDNA 序列ACGCTGGCGG CAGGCCTAAC ACATGCAAGT CGAGCGGATG AGAAGAGCTT 50GCTCTTCGAT TCAGCGGCGG ACGGGTGAGT AATGCCTAGG AATCTGCCTG 100GTAGTGGGGG ACAACGTTTC GAAAGGAACG CTAATACCGC ATACGTCCTA 150CGGGAGAAAG CAGGGGACCT TCGGGCCTTG CGCTATCAGA TGAGCCTAGG 200TCGGATTAGC TAGTTGGTGA GGTAATGGCT CACCAAGGCG ACGATCCGTA 250ACTGGTCTGA GAGGATGATC AGTCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAGA 300CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAATGGG CGAAAGCCTG 350ATCCAGCCAT GCCGCGTGTG TGAAGAAGGT CTTCGGATTG TAAAGCACTT 400TAAGTTGGGA GGAAGGGCA TAACCTAATA CGTTAGTGTT TTGACGTTAC 45013 / 29TCGACAGAATA AGCACCGGCT AACTCTGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACAG 500AGGGTGCAAG CGTTAATCGG AATTACTGGG CGTAAAGCGC GCGTAGGTGG 550TTTGTTAAGT TGGATGTGAA AGCCCCGGGC TCAACCTGGG AACTGCATCC 600AAAACTGGCA AGCTAGAGTA CGGTAGAGGG TGGTGGAATT TCCTGTGTAG 650CGGTGAAATG CGTAGATATA GGAAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACCAC 700CTGGACTGAT ACTGACACTG AGGTGCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT 750TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGTCAACTA GCCGTTGGAA 800TCCTTGAGAT TTTAGTGGCG CAGCTAACGC ATTAAGTTGA CCGCCTGGGG 850AGTACGGCCG CAAGGTTAAA ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA 900GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG 950CCTTGACATG CAGAGAACTT TCCA