【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 100象素，就只剩下16個(gè)細(xì)胞了。當(dāng)調(diào)整過濾數(shù)值時(shí)，圖片上的object標(biāo)志也會(huì)動(dòng)態(tài)地顯示，過濾掉的object會(huì)立即消失。還有問題。圖片中有兩個(gè)細(xì)胞緊挨在一起的，被識(shí)別成一個(gè)object了。而另外還有細(xì)胞因?yàn)樘?，被識(shí)別成兩個(gè)甚至更多的object了。這只能用人工把它們分開或合并。在count/size窗口的edit菜單下，上面的幾個(gè)split命令就是用來分割連在一起的object的。auto split 與watershed split都是自動(dòng)分割，操作簡(jiǎn)單，但很少分成準(zhǔn)確。split是手工分割，點(diǎn)此后出現(xiàn)一個(gè)小窗口，用鼠標(biāo)在相連的兩個(gè)object的連接處劃一條短線，將兩個(gè)分開，再點(diǎn)一下右鍵就行了。把圖片上所有相連的object全分割后再點(diǎn)一下小窗口的OK按紐。再回去count一遍，分割就生效了。limited watershed split也是手工法分割。這種分割方法是半自動(dòng)的。道理有點(diǎn)象漲大水。兩個(gè)挨著的山峰，在山腳處是相連的，如果山下漲了洪水，這兩座山峰就會(huì)徹底被水隔開了。但是水漲多高才能把兩個(gè)山峰隔開呢？這個(gè)limited就是讓你自己掌握漲水的程度。以便分割得更準(zhǔn)確。按照說明書的意思，需要輸入的數(shù)值是漲水最多淹沒多少象素的數(shù)值。有挨在一起的細(xì)胞，就有一個(gè)細(xì)胞被識(shí)別成兩個(gè)以上object的。用手工將它們合并的命令是Draw/merge objects。這跟split的操作類似，只是不劃線，而是畫一個(gè)圈，把幾個(gè)本應(yīng)在一起的Objects圍起來就行了。看到這里，是不是覺得很麻煩？鼓搗了半天，真還不如在顯微鏡下拿著計(jì)數(shù)器去數(shù)呢。其實(shí)這里的問題在于拍攝照片，如果能拍攝出清晰的細(xì)胞照片，沒有渣點(diǎn)，細(xì)胞分布也很均勻，用IPP來數(shù)密密麻麻的細(xì)胞還是能作到的。如果圖片中有兩類不同的細(xì)胞，IPP也能進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。class的意思就是分類。但前提是照片中的兩類細(xì)胞得有明顯的區(qū)別，比如顏色不同、大小不同或亮度不同。這個(gè)麻煩事以后再談吧。剛才的圖片中有一些比較暗的細(xì)胞沒有被計(jì)算進(jìn)去，可見auto bright object并不靈驗(yàn)，還得用segmentation工具來選色呀，看看這回的計(jì)數(shù)效果吧。具體作法大家當(dāng)作作業(yè)自己試試吧，我是用吸管工具來選色的，這張圖片大家很熟悉吧？里面有紅綠兩種顏色的細(xì)胞，可以用分類計(jì)數(shù)的方法同時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算結(jié)束是看range statistics。里面給出了兩類細(xì)胞的計(jì)數(shù)比例。好啦，這個(gè)主題就到此為止吧。如果你想用IPP來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的話，一定要照下清晰干凈的照片再來處理。否則會(huì)累死你。校正標(biāo)尺在你打算學(xué)學(xué)標(biāo)尺的操作并自己動(dòng)手在自己電腦上玩玩標(biāo)尺之前，要確認(rèn)自己是要?jiǎng)诱娓竦貙W(xué)會(huì)怎樣設(shè)置這些東東。因?yàn)橐坏?biāo)尺設(shè)置錯(cuò)誤了，以后所有的幾何測(cè)量數(shù)值都會(huì)出錯(cuò)的。而且不會(huì)因?yàn)槟汴P(guān)閉程序或關(guān)閉電腦就能Reset了。如果你因?yàn)樵谶@里學(xué)著定標(biāo)尺而搞亂了你的IPP程序，可別埋怨我。 在前面的帖子中我一直沒提及標(biāo)尺，因此在提到測(cè)量面積直徑等幾何尺寸時(shí)都用象素作為單位。如果你需要測(cè)量微觀物體的準(zhǔn)確幾何尺寸，那就得進(jìn)行標(biāo)定操作后才行。 還有一個(gè)需要標(biāo)定的是光密度，這可就比幾何標(biāo)尺困難多了。對(duì)光密度進(jìn)行標(biāo)定我覺得麻煩而且不準(zhǔn)確，在實(shí)際應(yīng)用中我們一般都只測(cè)量相對(duì)的光密度對(duì)比，因此對(duì)光密度進(jìn)行標(biāo)定實(shí)在是吃力不討好的事。所以關(guān)于光密度標(biāo)定的部分我也實(shí)在懶得費(fèi)力去寫了。（修訂：這段話看來是大錯(cuò)特錯(cuò)了，光密度較正是必須要作的，否則在進(jìn)行灰度分析時(shí)肯定會(huì)出錯(cuò)，我在后面重新寫了一個(gè)相關(guān)的帖子）不過本論壇里曾有人討論過相關(guān)的內(nèi)容。 標(biāo)定標(biāo)尺還需要有個(gè)物質(zhì)準(zhǔn)備，就是得有一個(gè)叫“微標(biāo)尺”的小玻璃片。上面刻有準(zhǔn)確的刻度，在1MM的長(zhǎng)度上刻著100個(gè)分度刻度。得在專業(yè)的顯微鏡生產(chǎn)商那才能買到，或者在買顯微鏡時(shí)把這個(gè)當(dāng)作附件給買下來。如果沒有這玩藝怎么辦？還真有點(diǎn)難辦。照理說如果有一個(gè)能放在載片上的尺寸已知的小東西也是可以的，這個(gè)東西首先得足夠小，其次得準(zhǔn)確知道它的尺寸。我現(xiàn)在能夠想到的東西就是血球計(jì)數(shù)板。它的尺寸就是1平方毫米，分了幾個(gè)大格和小格，線條精度雖然比不上微標(biāo)尺，但誤差也不會(huì)太大。可以湊合著用。上面說的是使用顯微鏡照片時(shí)用的標(biāo)尺。如果你處理的是大個(gè)物體的照片，那就在物體邊上放個(gè)米尺就行了。在拍攝物體的同時(shí)也把米尺的圖象拍下來。 使用標(biāo)尺來標(biāo)定幾何尺寸的方案是這樣的：先用顯微鏡拍攝下微尺的圖象，再用顯微鏡拍攝下樣品顯微圖象，最后用微尺的圖象來“量”樣品圖象的幾何尺寸。在IPP中，程序先記住1MM相當(dāng)于多少象素，然后測(cè)量樣品圖象的幾何尺寸時(shí)只要先算出象素值，一換算就得了。 最重要的一點(diǎn)就是，現(xiàn)在的數(shù)碼相機(jī)都有無級(jí)變焦，可以任意放大縮小畫面。因此要特別注意，在拍攝微尺圖象與拍攝樣品圖象時(shí)，絕對(duì)不能調(diào)節(jié)相機(jī)的變焦（ZOOM）。 顯微鏡一般都有4倍、10倍、40倍、100倍甚至更多物鏡?？梢苑謩e用這些物鏡拍攝下不同的微標(biāo)尺圖象，在處理不同物鏡下拍攝的照片時(shí)使用各自對(duì)應(yīng)的標(biāo)尺。 具體的操作步驟如下：使用標(biāo)尺的第一步就是拍攝微標(biāo)尺的照片。拍一張是不行的。如果你的顯微鏡有4個(gè)物鏡分別是4X、10X、40X、100X，那么就要分別拍攝下這四個(gè)鏡頭下的標(biāo)尺圖象。如果你的像機(jī)是非變焦鏡頭，還不錯(cuò)。不用管變焦的事。我的相機(jī)有五級(jí)變焦，其中光學(xué)變焦三級(jí)，數(shù)字變焦兩級(jí)。而三級(jí)光學(xué)變焦中，兩個(gè)短焦距變焦拍攝的圖象亮度不均勻，不能用。數(shù)字變焦不予考慮。因?yàn)槲夜潭ㄊ褂靡粋€(gè)焦距。否則每個(gè)變焦都要拍攝標(biāo)尺照片。數(shù)碼相機(jī)拍攝畫面還有不同象素。分別是低、中、高三個(gè)檔次。三種象素畫面大小是不同的，因此也要分別拍攝它們的標(biāo)尺圖片。4個(gè)鏡頭，五種變焦，三種象素。共需拍攝4*5*3=60張不同的標(biāo)尺圖片。我偷懶，只拍攝4種鏡頭下各自的標(biāo)尺照片，相機(jī)變焦與象素選擇都只用一種。如果你的相機(jī)是無級(jí)連續(xù)變焦的，可得小心，得固定一個(gè)變焦值。圖中分別是100X、40X、10X物鏡下的微標(biāo)尺照片。 設(shè)置標(biāo)尺的菜單命令在measure carlibration spatial，彈出標(biāo)尺標(biāo)定的菜單來。1點(diǎn)擊菜單中的new按紐。新建一個(gè)標(biāo)尺，然后再最上面Name項(xiàng)下的spatial cal 0處點(diǎn)一下，改成40XlowR。這是新建標(biāo)尺的名稱。雖然名稱是可以隨便取的，但最好能反映拍攝條件，40X表示物鏡為40X，lowR表示數(shù)碼相機(jī)采用最低象素畫面格式。別用中文字符。這是標(biāo)尺單位，顯微鏡圖片用微米來計(jì)量長(zhǎng)度單位最合適。當(dāng)然可以用別的，比 如KM作單位，圖片上一個(gè)小尺的長(zhǎng)度就是幾千萬分之一公里。 when change unit選項(xiàng)，給勾上。，就立即彈出scaling對(duì)話框，同時(shí)在標(biāo)尺圖片左上角顯出一個(gè)標(biāo)尺，將鼠標(biāo)移到這個(gè)標(biāo)尺的橫杠上，點(diǎn)一下左鍵，光標(biāo)就立即變成了小手，就用這個(gè)小手把光標(biāo)拖下來，再將光標(biāo)分別移到移到橫杠的左右兩端，用左鍵拖這兩個(gè)端點(diǎn)到圖片兩邊的標(biāo)尺該線處。在這一步操作中，兩個(gè)端點(diǎn)位置必須準(zhǔn)確。一個(gè)方法是點(diǎn)scaling中的放大鏡按紐調(diào)出放大窗口，可以看到鼠標(biāo)所在處的放大圖形。另一個(gè)方法是把標(biāo)尺的兩端放在短刻線的線頭處，這樣選點(diǎn)更準(zhǔn)確。從下圖的兩個(gè)放大鏡圖象中可看出，端點(diǎn)在刻線中間時(shí)上下位置是沒法選準(zhǔn)的。而在刻線頭處，上下左右都有參照，可以準(zhǔn)確選中位置。在選端點(diǎn)位置時(shí)要盡量向兩邊拉，拉得越遠(yuǎn)，誤差越小。，數(shù)一下兩個(gè)端點(diǎn)之間有多少間隔，這個(gè)微尺每格10um，兩端點(diǎn)間為二十小格，長(zhǎng)度為200um，所以要在scaling里填上200。，回到spatial carlibration窗口。 大功告成了。點(diǎn)close關(guān)閉窗口結(jié)束。如果你覺得這個(gè)標(biāo)尺作得不對(duì)，得重作，可以重新打開窗口，在Name中選出這個(gè)標(biāo)尺，點(diǎn)image重新找端點(diǎn)。如果覺得不保險(xiǎn)，就干脆點(diǎn)delete。關(guān)閉窗口，再打開它，剛才那個(gè)標(biāo)尺就沒有了，可以重新新建標(biāo)尺。重復(fù)上面的步驟，把10X與100X鏡下的標(biāo)尺也給標(biāo)定一下。窗口下面的幾個(gè)選項(xiàng)都不要?jiǎng)铀?，保留默認(rèn)值。那些是較正圖象變形用的。誰敢說你用的顯微鏡或照相機(jī)有圖像變形，廠家會(huì)跟你急眼的。至少我現(xiàn)在用的olympus顯微鏡圖象沒有一點(diǎn)看得出來的變形設(shè)定了標(biāo)尺，就可以在圖片中應(yīng)用它了。 carlibration select spatial?；蛘唿c(diǎn)工具欄里的卡尺圖標(biāo)，就調(diào)出了標(biāo)尺選擇窗口。，點(diǎn)適用的那個(gè)。這樣就完成了標(biāo)尺的第一個(gè)作用：應(yīng)用了此標(biāo)尺后，測(cè)量出來的幾何數(shù)據(jù)就不是象素了，而是實(shí)際的幾何測(cè)量值（微米、平方微米等）下面再使用標(biāo)尺的第二個(gè)功能：往圖片上加標(biāo)尺標(biāo)記。再點(diǎn)擊marker按紐（不是點(diǎn)OK按紐）。這回彈出的是spatial calibration marker窗口。這兩種選擇的后續(xù)操作步驟居然不一樣?。?！區(qū)別在于：一種標(biāo)尺是”燒進(jìn)“圖象中的，加上標(biāo)尺的圖象已經(jīng)被改動(dòng)了，另一種標(biāo)尺是浮在圖象上的，只能在IPP程序中看到，在別的程序中是看不到打上的標(biāo)尺的。具體方法下兩帖單獨(dú)講。長(zhǎng)短要合適。如果尺的長(zhǎng)度小于標(biāo)尺文字（10um這幾個(gè)字）長(zhǎng)度，會(huì)很難看的，需要多試幾個(gè)長(zhǎng)度，擇優(yōu)錄取。，就消不掉了，所以標(biāo)記上標(biāo)尺的圖片最好另存一張。！切記切記！否則長(zhǎng)度肯定會(huì)標(biāo)錯(cuò)的。當(dāng)Style樣式選用的是ONimage時(shí)，下面有四個(gè)不同的小尺形式。從中點(diǎn)一個(gè)選上，再選好小尺長(zhǎng)度，點(diǎn)OK會(huì)彈出一個(gè)新窗口，圖片中也會(huì)出現(xiàn)小標(biāo)尺。它的位置就是上次選標(biāo)尺的位置。平時(shí)我們喜歡把小標(biāo)尺放在圖片下方，所以這個(gè)小標(biāo)尺經(jīng)常是出現(xiàn)在圖片下方的。繼續(xù)點(diǎn)continue回到標(biāo)尺選擇窗口（Active spatial calibration），現(xiàn)在就可以點(diǎn)OK關(guān)閉（可不能點(diǎn)marker按紐）標(biāo)尺選擇窗口了。從小標(biāo)尺出現(xiàn)在圖片上的時(shí)候開始，直到現(xiàn)在，你都可以用鼠標(biāo)左健拖動(dòng)小標(biāo)尺，移動(dòng)位置，到位后點(diǎn)一下右鍵就把它給定住了。至此就永久地標(biāo)上了小標(biāo)尺了。如果作錯(cuò)了哪一步想從頭來，得先關(guān)閉圖片（一定要選擇不保存），關(guān)閉全部窗口，再重新來一遍。當(dāng)Style樣式選用的是Nondestructive時(shí)，下面有三個(gè)不同的小尺形式。從中點(diǎn)一個(gè)選上，再選好小尺長(zhǎng)度，還可以自選標(biāo)尺的顏色（這是上一個(gè)方法里作不到的）。點(diǎn)OK進(jìn)入下一步?，F(xiàn)在出來一個(gè)continue窗口，標(biāo)尺及其文字也出來了?，F(xiàn)在別著急點(diǎn)continue，在標(biāo)尺上用左鍵點(diǎn)一下，再用左鍵拖，把它移到位。文字與標(biāo)尺是分別拖的，這樣文字的位置可以靈活地放。標(biāo)尺和文字都拖到位后再點(diǎn)continue，一旦點(diǎn)了continue就不能后悔了?；氐竭x擇窗口后點(diǎn)OK關(guān)閉。光看這些啰哩啰嗦的說明肯定記不住。只能自己操作幾遍才行。IPP的標(biāo)尺功能好象有點(diǎn)BUG，有時(shí)候真的不靈。打上的標(biāo)尺很難看。這是因?yàn)椴还軋D象的實(shí)際大小，顯示的圖象幾乎都是那么大，如果是一張大圖片，因?yàn)轱@示時(shí)圖片被縮小了，所以標(biāo)尺也被縮小了，結(jié)果看上去文字與標(biāo)尺本身都顯得小而不清晰。其實(shí)如果用實(shí)際象素來顯示圖片的話，標(biāo)尺就會(huì)清晰了。如果你在IPP中設(shè)定了標(biāo)尺，就一定要設(shè)對(duì)，否則所有的計(jì)算結(jié)果都是錯(cuò)誤的換算數(shù)據(jù)。而且IPP的記性非常好，即使你關(guān)閉程序了，關(guān)閉電腦了，它還是記得你設(shè)置了一個(gè)標(biāo)尺，下回你使用IPP時(shí)它還是自動(dòng)地應(yīng)用這個(gè)標(biāo)尺，所以每次開始使用IPP的時(shí)候，一定要點(diǎn)一下工具欄里的卡尺按紐，選擇一下標(biāo)尺，如果不想應(yīng)用標(biāo)尺，就一定要選none?？傊欢ㄒx一個(gè)。即使你不想在圖片上打標(biāo)尺，也要選一下，因?yàn)楦鞣N幾何測(cè)量的值已經(jīng)被這個(gè)標(biāo)尺設(shè)置給換算了。設(shè)定了標(biāo)尺后，幾何測(cè)量值就不是象素值，而是換算成微米值了。所以如果你一旦動(dòng)過IPP的標(biāo)尺設(shè)置，就一定要把這個(gè)主題給看明白，學(xué)會(huì)。否則你的數(shù)據(jù)幾乎肯定會(huì)出錯(cuò)的。而且經(jīng)常是錯(cuò)了還不知道錯(cuò)在哪里。本主題到此結(jié)束。關(guān)于與光密度校準(zhǔn)相關(guān)的操作，將在另外的主題中討論。幾何測(cè)量在上一主題我講了設(shè)定標(biāo)尺的方法，設(shè)定了標(biāo)尺后，還要選擇定義標(biāo)尺，才能測(cè)量幾何尺寸。因此在這一主題里的幾何測(cè)量中，首先定義標(biāo)尺是必須的。定義標(biāo)尺與在圖片上打上標(biāo)尺記號(hào)是兩回事。定義標(biāo)尺的操作并不在圖片上留下任何痕跡。但所有測(cè)量數(shù)據(jù)卻被換算成實(shí)際的長(zhǎng)度數(shù)值了，而在圖片上打標(biāo)尺記號(hào)的操作也就自然地定義了標(biāo)尺。實(shí)際上在前面的count/size中的measure中，我們已經(jīng)作過許多幾何測(cè)量，比如測(cè)量各個(gè)AOI的面積，平均半徑，長(zhǎng)寬比例。在那個(gè)select measurement窗口中除了一些光密度測(cè)量項(xiàng)目外，還有一長(zhǎng)串的幾何測(cè)量選項(xiàng)可以運(yùn)用。你們是否注意到，所有這些幾何測(cè)量項(xiàng)目都有一個(gè)共同的因素都是測(cè)量一個(gè)區(qū)域的幾何尺寸。因此，在點(diǎn)、線、面、體這四個(gè)方面，前面所能作到的 測(cè)量只包括了面的測(cè)量，所以我們還得知道一些點(diǎn)和線的測(cè)量方法。至于體的測(cè)量，現(xiàn)在還不敢想。隨便打開一張圖片玩吧，點(diǎn)measure measurements。主要的測(cè)量工具就在這里了。左上角的features框里就是這個(gè)工具能作的測(cè)量。最下面居然也有count/size，可見軟件商對(duì)這個(gè)count/size工具是多么得意。在這個(gè)框里找個(gè)測(cè)量項(xiàng)目點(diǎn)一下，就出來一個(gè)小對(duì)話框指導(dǎo)你該怎么操作。我挑幾個(gè)有意思的說說。最上面的點(diǎn)工具我們用過吧。其實(shí)那不是為了數(shù)數(shù)用的，而是測(cè)量點(diǎn)的位置的。用它在圖上點(diǎn)一個(gè)測(cè)量點(diǎn)后，這個(gè)點(diǎn)的坐標(biāo)就在旁邊的窗口里顯示出來了。當(dāng)你點(diǎn)曲線按紐時(shí)，出來的工具與AOI的irregular工具一模一樣。只是在選AOI時(shí)，它一定會(huì)走一個(gè)閉合曲線。這里它可以走一個(gè)任意形狀的曲線，也是可以自己拖，可以循邊界自動(dòng)找。在自動(dòng)找線時(shí)要先點(diǎn)左鍵讓它停下來，再點(diǎn)右鍵確認(rèn)。量角度的兩個(gè)工具有啥區(qū)別?前一個(gè)畫著角線的工具是讓你在圖上自己畫兩條直線，測(cè)其角度。量角器那個(gè)工具是量圖上已經(jīng)有的兩條線之間的角度。那些已經(jīng)有的直線得是用上面畫直線的工具畫上去的。倒數(shù)第二排的測(cè)兩條線之間的距離的工具也是需要先用直線或曲線工具先在圖上畫好兩條線后才能使用。IPP也有說話不算話的時(shí)候。比如畫點(diǎn)擬合線時(shí)可以畫上很多點(diǎn)，然后點(diǎn)右鍵就出來了擬合直線。畫點(diǎn)擬合園或弧的時(shí)候分明說的是可以畫三個(gè)以上的點(diǎn)，結(jié)果點(diǎn)三個(gè)點(diǎn)就立即出來一個(gè)園或弧。當(dāng)你用這些工具在圖片上畫了一堆亂七八糟的線條后，只要點(diǎn)一下上面的叉按紐，就能消除掉它們了。右邊顯示的測(cè)量數(shù)值也可以傳到Excel。