【正文】 計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。在count/size窗口的edit菜單下，上面的幾個(gè)split命令就是用來(lái)分割連在一起的object的。兩個(gè)挨著的山峰，在山腳處是相連的，如果山下漲了洪水，這兩座山峰就會(huì)徹底被水隔開(kāi)了。其實(shí)這里的問(wèn)題在于拍攝照片，如果能拍攝出清晰的細(xì)胞照片，沒(méi)有渣點(diǎn)，細(xì)胞分布也很均勻，用IPP來(lái)數(shù)密密麻麻的細(xì)胞還是能作到的。里面給出了兩類(lèi)細(xì)胞的計(jì)數(shù)比例。 在前面的帖子中我一直沒(méi)提及標(biāo)尺，因此在提到測(cè)量面積直徑等幾何尺寸時(shí)都用象素作為單位。得在專(zhuān)業(yè)的顯微鏡生產(chǎn)商那才能買(mǎi)到，或者在買(mǎi)顯微鏡時(shí)把這個(gè)當(dāng)作附件給買(mǎi)下來(lái)。在拍攝物體的同時(shí)也把米尺的圖象拍下來(lái)。拍一張是不行的。否則每個(gè)變焦都要拍攝標(biāo)尺照片。圖中分別是100X、40X、10X物鏡下的微標(biāo)尺照片。這是標(biāo)尺單位，顯微鏡圖片用微米來(lái)計(jì)量長(zhǎng)度單位最合適。而在刻線頭處，上下左右都有參照，可以準(zhǔn)確選中位置。關(guān)閉窗口，再打開(kāi)它，剛才那個(gè)標(biāo)尺就沒(méi)有了，可以重新新建標(biāo)尺。，點(diǎn)適用的那個(gè)。長(zhǎng)短要合適。繼續(xù)點(diǎn)continue回到標(biāo)尺選擇窗口（Active spatial calibration），現(xiàn)在就可以點(diǎn)OK關(guān)閉（可不能點(diǎn)marker按紐）標(biāo)尺選擇窗口了?，F(xiàn)在別著急點(diǎn)continue，在標(biāo)尺上用左鍵點(diǎn)一下，再用左鍵拖，把它移到位。這是因?yàn)椴还軋D象的實(shí)際大小，顯示的圖象幾乎都是那么大，如果是一張大圖片，因?yàn)轱@示時(shí)圖片被縮小了，所以標(biāo)尺也被縮小了，結(jié)果看上去文字與標(biāo)尺本身都顯得小而不清晰。否則你的數(shù)據(jù)幾乎肯定會(huì)出錯(cuò)的。但所有測(cè)量數(shù)據(jù)卻被換算成實(shí)際的長(zhǎng)度數(shù)值了，而在圖片上打標(biāo)尺記號(hào)的操作也就自然地定義了標(biāo)尺。左上角的features框里就是這個(gè)工具能作的測(cè)量。只是在選AOI時(shí)，它一定會(huì)走一個(gè)閉合曲線。比如畫(huà)點(diǎn)擬合線時(shí)可以畫(huà)上很多點(diǎn)，然后點(diǎn)右鍵就出來(lái)了擬合直線。從我自己的體會(huì)來(lái)說(shuō)，幾乎每一項(xiàng)分析其策略都不同。因?yàn)檫@個(gè)平均光密度值的真值就是這張圖片整個(gè)的平均光密度值。前面的照片中有幾張看上去背景是淺藍(lán)色的，這就是數(shù)碼相機(jī)的自動(dòng)白平衡功能在起作用。，陰性細(xì)胞光強(qiáng)度很弱?？墒前迅鹘M切片都這么測(cè)量一下，問(wèn)題就來(lái)了，別忘了每組有十來(lái)張切片，其光密度值各有不同，因此進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)，除陰性組以外，其他各組之間并無(wú)顯著性差異。陽(yáng)性區(qū)域Area是Area的SUM值。以后再慢慢增加。這樣的圖片很好看，如果你想保存下這樣標(biāo)記上各種記號(hào)的的圖片，該怎么作呢？按print screen截圖是最笨的招。正象那些保健品廣告詞里所說(shuō)“真的有效吔”。好象是照的圖片越多效果越好。因此想回避它。在計(jì)算機(jī)的圖片格式中，一點(diǎn)象點(diǎn)的“亮”與“暗”是通過(guò)定義相素點(diǎn)的“灰度”來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)OD值等于0的時(shí)候，對(duì)光線無(wú)吸收，透射率100%。因?yàn)楣鈴?qiáng)與光密度之間是指數(shù)關(guān)系。我們是通過(guò)對(duì)照片的灰度進(jìn)行分析來(lái)測(cè)量樣品的光密度的。這實(shí)際就是一個(gè)扣除背景的操作。，新建一個(gè)caliberation set，在下面點(diǎn)擊std optical density。定黑點(diǎn)時(shí)需要有標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。在一組照片中，背景雖然不一樣但不會(huì)差得太多，找一個(gè)最大的（最亮的）設(shè)為其公用的背景值也是可以的。陽(yáng)性樣品切片染色深?，F(xiàn)在光密度的值是反的，陽(yáng)性越大，光密度的數(shù)值越小，IOD值反而變小，這不是全擰了嗎？可見(jiàn)光密度的校正是必須要作的。大家一定注意到了火鍋的作法與我的作法有點(diǎn)區(qū)別。另一張則關(guān)閉了這個(gè)功能。這樣照片是順眼了一點(diǎn)，但是背景值的光密度卻被增加了，陽(yáng)性區(qū)域的光密度卻被減少了。最近看到一個(gè)新技術(shù)挺不錯(cuò)，就是把各個(gè)樣品定位后，各切出一個(gè)小細(xì)條，整整齊齊排成一個(gè)陣列，包埋在蠟塊中，切成一片切片，然后進(jìn)行免疫組化反應(yīng)及染色處理。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機(jī)的自動(dòng)白平衡功能給關(guān)掉！??！ ，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。打開(kāi)要分析的圖片后首先要進(jìn)行光密度校正。較正背景的值會(huì)在曲線的X軸端中表現(xiàn)出來(lái)。保存這個(gè)文件的目的是為了制作宏操作用的。作法如下：，在preview中選transparent on white，這時(shí)圖片中未被選中的區(qū)域都被填上了白色。IOD的確與上面所作的不同。實(shí)際上比較的就是整個(gè)視野的平均光密度。如果視野內(nèi)還有不同類(lèi)型的組織區(qū)域，不應(yīng)被計(jì)算進(jìn)去，可以用不規(guī)則曲線工具選中這些區(qū)域，用edit filled 把它們填上白色。：measurement：area（1010000000），IOD（0100000000）option：outline：none，label style：none .clean border：none然后點(diǎn)file save setting，文件位置最好是分析的圖片文件夾里 color 里選HIS：H 030，S，I0255，然后點(diǎn)下面的file按紐，save ，也存到圖片文件夾目錄中。 color，在調(diào)出的窗口中點(diǎn)HSI，再點(diǎn)load file。得到一張灰度圖片。比較陽(yáng)性區(qū)域的density mean=IOD（sum）/area（sum） （這里的area是黃色部分的area）有時(shí)圖片上僅有部分區(qū)域有樣品，還有大片區(qū)域是空白。可是自己制作宏也是挺麻煩的。希望你看過(guò)了前面的手把手教你使用IPP的系列。然后在記事本里修改這。先把這個(gè)試用版本傳給大家，正式版本則需到Media Cybnetics網(wǎng)站上下載。無(wú)論是經(jīng)常使用IPP還是第一次使用，如果需要分析測(cè)量一大批圖片的話，都免不了要花費(fèi)大量時(shí)間。各有不同的選取。只好分成兩步作宏操作。把這張黑白圖片保存。注意以下的所有操作都只能用鼠標(biāo)點(diǎn)，不能動(dòng)任何鍵。制作宏的操作：一、準(zhǔn)備工作：。這只要在面積測(cè)量中設(shè)一個(gè)大一點(diǎn)的過(guò)濾值就行，比如只計(jì)算面積大于200象素的區(qū)域。此時(shí)IOD值就能反映出這兩張圖片染色程度的不同。整個(gè)照片都選上，當(dāng)然，選0到250也行，沒(méi)選上的都是白色區(qū)域，測(cè)量沒(méi)有影響。IOD SUM是圖片中黃色區(qū)域的累積光密度，area SUM則是選中的黃色區(qū)域的面積。然后要保存count/size窗口的設(shè)置，點(diǎn)count/size窗口的 file save settings，將當(dāng)前的測(cè)量設(shè)置文件保存，最好與圖片文件存在同一個(gè)文件夾里，免得以后找不到。許多相機(jī)拍的顯微鏡照片是中間稍亮，四周暗。既不偏黃，也不偏藍(lán)。保持各張切片的拍攝條件一致更重要。我這里說(shuō)的免疫組化圖片，是這樣的一類(lèi)圖片：染上的顏色是黃色，如果染得濃，就呈現(xiàn)棕黃色。當(dāng)你拍攝黃色的免疫組化切片時(shí)，相機(jī)會(huì)認(rèn)為照片太黃，必須增加點(diǎn)藍(lán)色平衡一下。 還有一個(gè)影響光密度的因素。也許扣了背景以后，能使兩組之間的差異更明顯，也許作不到這一點(diǎn)。但I(xiàn)OD卻變得沒(méi)有差異了! 。 還是作個(gè)實(shí)例來(lái)分析吧。把圖片上最淺的地方定義為OD=0每張照片上這個(gè)值都不會(huì)一樣的。測(cè)量的光密度數(shù)值與樣品濃度呈正比關(guān)系，而以前的灰度值是與樣品濃度成指數(shù)關(guān)系的。出現(xiàn)的窗口里是空的?；叶葹榱愕膿Q算為無(wú)窮大，灰度為255的換算為0。由上面的分析我們可以看出，實(shí)際上灰度是我們用電腦進(jìn)行圖象分析時(shí)所用的中間變量。這就帶來(lái)了極大的不方便，很容易就出現(xiàn)錯(cuò)誤。OD值（optical density）叫光學(xué)密度，定義為吸收光線物質(zhì)的光學(xué)密度，它與該物質(zhì)的物理密度應(yīng)該是線性相關(guān)的。能夠給別人講解清楚了，才是真正弄明白了。等老板買(mǎi)了激光共聚焦顯微鏡，估計(jì)就得用上這些功能。，出來(lái)一個(gè)新的合成圖片，真的很清晰的。直到全部畫(huà)面都變虛為止。這種切片真鬧心，因?yàn)榍械暮穸却笄也痪鶆?，在高倍鏡下有的地方聚焦清楚，有的地方不清楚，如果把另一個(gè)地方對(duì)焦清楚了，這里又不清楚。這時(shí)最好的學(xué)習(xí)方法就是看幫助文件，不要看中文翻譯的說(shuō)明書(shū)，而是看程序自帶的Help。真希望大家學(xué)會(huì)了用IPP后把自己工作中的作法也加進(jìn)來(lái)交流交流。再加一招，計(jì)算每張圖片中的：陽(yáng)性區(qū)域光密度值（陽(yáng)性區(qū)域中陰性部分光密度值）=陽(yáng)性區(qū)域IOD（陰性區(qū)域density mean） X （陽(yáng)性區(qū)域Area）式中陽(yáng)性區(qū)域IOD是照片統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中IOD的SUM值。分別測(cè)量一下各個(gè)照片整體的平均光密度（density mean）。另外在細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)了光暈，給數(shù)字處理時(shí)的選色操作帶來(lái)了困難。包括曝光時(shí)間、變焦、光圈。有人是這樣作的：使用正圓形AOI工具，在一張免疫組化圖片上隨機(jī)選取五個(gè)位置，分別測(cè)量這五個(gè)位置上這個(gè)正圓形區(qū)域的平均光密度，得到一個(gè)平均光密度值與標(biāo)準(zhǔn)差。這并沒(méi)有一個(gè)權(quán)威的或者是已經(jīng)有定論的方法。倒數(shù)第二排的測(cè)兩條線之間的距離的工具也是需要先用直線或曲線工具先在圖上畫(huà)好兩條線后才能使用。用它在圖上點(diǎn)一個(gè)測(cè)量點(diǎn)后，這個(gè)點(diǎn)的坐標(biāo)就在旁邊的窗口里顯示出來(lái)了。隨便打開(kāi)一張圖片玩吧，點(diǎn)measure measurements。定義標(biāo)尺與在圖片上打上標(biāo)尺記號(hào)是兩回事。設(shè)定了標(biāo)尺后，幾何測(cè)量值就不是象素值，而是換算成微米值了。IPP的標(biāo)尺功能好象有點(diǎn)BUG，有時(shí)候真的不靈。點(diǎn)OK進(jìn)入下一步。它的位置就是上次選標(biāo)尺的位置。具體方法下兩帖單獨(dú)講。 carlibration select spatial。如果你覺(jué)得這個(gè)標(biāo)尺作得不對(duì)，得重作，可以重新打開(kāi)窗口，在Name中選出這個(gè)標(biāo)尺，點(diǎn)image重新找端點(diǎn)。另一個(gè)方法是把標(biāo)尺的兩端放在短刻線的線頭處，這樣選點(diǎn)更準(zhǔn)確。別用中文字符。我偷懶，只拍攝4種鏡頭下各自的標(biāo)尺照片，相機(jī)變焦與象素選擇都只用一種。數(shù)字變焦不予考慮?？梢苑謩e用這些物鏡拍攝下不同的微標(biāo)尺圖象，在處理不同物鏡下拍攝的照片時(shí)使用各自對(duì)應(yīng)的標(biāo)尺。上面說(shuō)的是使用顯微鏡照片時(shí)用的標(biāo)尺。 標(biāo)定標(biāo)尺還需要有個(gè)物質(zhì)準(zhǔn)備，就是得有一個(gè)叫“微標(biāo)尺”的小玻璃片。而且不會(huì)因?yàn)槟汴P(guān)閉程序或關(guān)閉電腦就能Reset了。具體作法大家當(dāng)作作業(yè)自己試試吧，我是用吸管工具來(lái)選色的，這張圖片大家很熟悉吧？里面有紅綠兩種顏色的細(xì)胞，可以用分類(lèi)計(jì)數(shù)的方法同時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。這跟split的操作類(lèi)似，只是不劃線，而是畫(huà)一個(gè)圈，把幾個(gè)本應(yīng)在一起的Objects圍起來(lái)就行了。這種分割方法是半自動(dòng)的。而另外還有細(xì)胞因?yàn)樘?，被識(shí)別成兩個(gè)甚至更多的object了。此表的橫坐標(biāo)數(shù)是面積的象素值，縱坐標(biāo)是對(duì)應(yīng)像素值面積有多少個(gè)object。所以選擇計(jì)數(shù)測(cè)量時(shí)可以讓電腦自動(dòng)選取亮物體作為識(shí)別標(biāo)志。因?yàn)闆](méi)作過(guò)具體的計(jì)數(shù)分析，因此這一主題寫(xiě)起來(lái)就有點(diǎn)尷尬了。還有個(gè)招就是把一組照片全部同時(shí)打開(kāi)，測(cè)量一個(gè)圖關(guān)閉一個(gè)圖，直到最后一張。數(shù)數(shù)你得點(diǎn)多少下鼠標(biāo)。我們就把這個(gè)重復(fù)動(dòng)作編成一個(gè)宏，把這步操作簡(jiǎn)化到兩步：用鼠標(biāo)移園圈到下一個(gè)細(xì)胞，按一下宏快捷鍵。，把這個(gè)圓轉(zhuǎn)換成一個(gè)object。分析目標(biāo)是每張片子中各個(gè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)強(qiáng)度，也就是其“黃色”的深與淺。幾秒鐘宏運(yùn)行結(jié)束后再處理下一張。 to Excel。 color 調(diào)出segmentation窗口。名字得是八個(gè)字母的英文名。設(shè)定了DDE option后，不要關(guān)閉statistics窗口。position data set row 1 col 1 這是指定數(shù)據(jù)從Excel表單的具體哪個(gè)位置開(kāi)始放，現(xiàn)在的行列值都是一，就是左上角。設(shè)置一下測(cè)量數(shù)據(jù)傳往Excel的規(guī)則，這很重要。在編制宏操作時(shí)，因?yàn)槭亲詣?dòng)操作，所以不能有人工選擇干預(yù)的操作動(dòng)作。class object 標(biāo)記為標(biāo)記class顏色，組織空白區(qū)域較亮的地方為背景區(qū)域。例如：一大批圖片，需要把它們的象素調(diào)整到一個(gè)較小的值以便上傳到網(wǎng)上。請(qǐng)繼續(xù)閱讀下一主題。如果把一部分選成black，其效果就等于把這一部分從圖象中摳去，這個(gè)處理也是很有用的。盡管幫助文件是英文的，看起來(lái)有點(diǎn)困難，但中文的幫助文件翻譯得不準(zhǔn)確，有時(shí)比英文的還難懂呢。 凡是玩電腦都必會(huì)有一個(gè)reset鍵。對(duì)area來(lái)說(shuō)，默認(rèn)值一般是0，意思是不管區(qū)域有多小，都被計(jì)入測(cè)量范圍內(nèi)。回到count/size窗口，按count紐，也一樣不好用?。?！或者點(diǎn)count后計(jì)算的區(qū)域根本就不是剛才選取的正確區(qū)域。S為色飽和度，I為強(qiáng)度。讓我們還是從打開(kāi)圖片并調(diào)出count/size窗口開(kāi)始吧。然后是OK按紐關(guān)閉measure窗口，點(diǎn)開(kāi)view菜單下的measurement date和statistics數(shù)據(jù)窗口。在count/size窗口右邊有一個(gè)option按紐，點(diǎn)開(kāi)它就能設(shè)定object標(biāo)記的外觀了。這時(shí)就要及時(shí)先點(diǎn)一下鼠標(biāo)使光標(biāo)暫停下來(lái)，然后在期望的方向延長(zhǎng)再點(diǎn)一下左鍵，給程序指明一下前進(jìn)的方向，如此多次，直到光標(biāo)回到起點(diǎn)為止。用鼠標(biāo)畫(huà)當(dāng)然是不會(huì)準(zhǔn)確的。一般不需要平滑，因此默認(rèn)值為零選中一個(gè)區(qū)域后如果還要在同一張圖片上再選另一個(gè)區(qū)域，不能直接點(diǎn)選，要先點(diǎn)擊一下工具欄上的Multiple AOI按紐，再點(diǎn)擊add，接下去就可以到另一個(gè)選擇區(qū)域點(diǎn)選。這個(gè)工具的標(biāo)題叫Magic wand，就是photoshop中的魔棒呀。此主題到此結(jié)束。這樣就把程序系統(tǒng)的灰度單位轉(zhuǎn)換成了光密度單位。訂正：在上述操作中漏掉了一個(gè)重要步驟，就是要轉(zhuǎn)換圖象intensity格式。前者是這個(gè)calss中每一個(gè)object的測(cè)量數(shù)據(jù)，后者是這些測(cè)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)參數(shù)，如總數(shù)、平均值、累加、標(biāo)準(zhǔn)差等。下在的小方框里則是吸管位置的選取顏色。一旦準(zhǔn)確地選取了AOI，下面的測(cè)量分析就好辦了。兩小時(shí)也太短。學(xué)會(huì)一個(gè)軟件需要花一段時(shí)間的，兩分鐘不可能學(xué)會(huì)。如何能夠準(zhǔn)確地選取AOI就是使用IPP的關(guān)鍵操作。用紅框圈起來(lái)的四個(gè)工具按紐分別是：吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。分別點(diǎn)擊count/size窗口中view菜單中的measurement data和statistics，就分別彈出這兩個(gè)數(shù)據(jù)窗口。但I(xiàn)OD卻是SUM值更有意義。最后點(diǎn)close關(guān)閉窗口。本人將另發(fā)帖子分別詳細(xì)敘述。在工具欄上點(diǎn)一下那個(gè)不規(guī)則園形的按紐，就調(diào)出了irregular工具條。smooth值是用來(lái)平滑區(qū)域邊界的。確認(rèn)工具條右邊的Auto選項(xiàng)沒(méi)有打勾，將光標(biāo)移至目標(biāo)圖形處按住左鍵拖出一個(gè)閉合圖形，點(diǎn)右鍵結(jié)束。可惜的是在許多情況下邊界是模糊不清的，光標(biāo)走到此處時(shí)會(huì)亂走一氣。object的標(biāo)記類(lèi)型是可以自己設(shè)定的。注意，選完后要點(diǎn)擊這