【正文】 擇Area、density（mean）及IOD三個測量項目，不使用測量過濾。這些簡單的操作雖然只需點幾下鼠標，但乘以100就費事了，作一個宏操作，處理每張圖片只需按一次快捷鍵，就省事多了，還不容易出錯。所以，如果你需要處理大量的圖片，花點時間學(xué)習(xí)編制自動操作的宏是值得的。當(dāng)你只處理一張圖片時，可真的用不上宏。關(guān)于AOI的技巧的討論到此結(jié)束。這個顏色參數(shù)文件非常有用。這樣在選擇顏色時能觀察尚未被選中的部分。二種方法各有其優(yōu)點，其共同之處就是把圖片中相同顏色的區(qū)域給定義成一個class，以便對它們進行分析處理。 關(guān)于segmentation窗口中其他一些按紐的用處，大家可以從幫助文件中查找。另外還有一個是反向選擇。前面所述的各種技巧需交替應(yīng)用。過濾是一種很有效的選取AOI的手段，除了定義面積范圍進行過濾以外，還可以選取BOX X/Y測量項目，這是object外切長方形的長寬比，如果是園形的object，這個值應(yīng)該是1，在作園形的細胞計數(shù)統(tǒng)計時，就可以濾掉長條形的雜質(zhì)Object,當(dāng)然同時也可以設(shè)面積過濾范圍。這時下面的start與end選項就變黑可調(diào)了。這樣選取的區(qū)域還是有一點不準確。壞事了，這個窗口的measure按紐是灰色的，不能用。這張照片中黃色區(qū)域為H：033。在HSI顏色格式中，H為色調(diào)，就是我們眼睛所看到的紅橙黃綠青藍紫等。窗口里有兩個表單，一個是color cube based，另一個是histogram based。所以對于segmentation工具還需要有更多的應(yīng)用技巧。這期間把數(shù)據(jù)窗口留著不關(guān)閉，可以看到新增的object測量數(shù)據(jù)會立即被更新。注意，選完后要點擊這個菜單中的measure按紐（而不是count/size窗口中的count按紐）。再下面是label的文字顏色。object的標記類型是可以自己設(shè)定的。 自動尋跡挺好玩吧?不過別忘了我們的目的?？上У氖窃谠S多情況下邊界是模糊不清的，光標走到此處時會亂走一氣。把那個Auto給選上，speed值給減到1（慢速看得清楚），在目標圖形的邊緣處左鍵點一下鼠標，然后沿著邊緣稍移動一下鼠標后再點擊一下左鍵，這是給程序指明一個尋跡的方向，馬上就能看到光標自動沿著邊界走起來了，一直會走到起點處才會停止。確認工具條右邊的Auto選項沒有打勾，將光標移至目標圖形處按住左鍵拖出一個閉合圖形，點右鍵結(jié)束。結(jié)束后如果又想再增加選擇區(qū)域，只要再點一下newAOI按紐，就可以調(diào)出工具條繼續(xù)增加選擇區(qū)域。smooth值是用來平滑區(qū)域邊界的。較大的值為較大的灰度范圍，點一下能選中一大片區(qū)域，較小的range值則為較小的灰度范圍。在工具欄上點一下那個不規(guī)則園形的按紐，就調(diào)出了irregular工具條。一個就是我們已經(jīng)看過的segmentation工具，另一個是irregular工具。本人將另發(fā)帖子分別詳細敘述。將光密度單位設(shè)定為system之后就不必再對后面的每一張照片都進行光密度校正了。最后點close關(guān)閉窗口。如果不進行光密度單位的轉(zhuǎn)換，測量的數(shù)值將完全是錯誤的。但IOD卻是SUM值更有意義。測量數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入EXCEL處理起來最方便。分別點擊count/size窗口中view菜單中的measurement data和statistics，就分別彈出這兩個數(shù)據(jù)窗口。選取完AOI后，點擊close回到count/size窗口，下一步就可以對選中的object進行測量操作了。用紅框圈起來的四個工具按紐分別是：吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。 在窗口中選中manual，再點擊select color，彈出顏色選擇窗口segmentation，這個工具是IPP最有特色的顏色選取工具之一。如何能夠準確地選取AOI就是使用IPP的關(guān)鍵操作。處理目標是通過測量圖片中黃色部分的黃度來反映相應(yīng)蛋白表達的的“量”。學(xué)會一個軟件需要花一段時間的，兩分鐘不可能學(xué)會。入門Imageproplus（IPP）的主要用途是分析測量圖象。兩小時也太短。對該圖片進行觀察，可以看到圖片中主要有三種主要顏色，一是染成藍色的細胞核，二是呈現(xiàn)出黃色的胞漿，三是細胞間的空隙區(qū)域，呈現(xiàn)出淺藍色，是為背景。一旦準確地選取了AOI，下面的測量分析就好辦了。用好這個工具是使用IPP的要點于目標顏色鮮明的圖片，用吸管工具是最簡單的。下在的小方框里則是吸管位置的選取顏色。點擊count/size窗口中的measure菜單，點select measure，這是選擇要進行何種測量操作，在彈出的測量選擇窗口左側(cè)列出了各種可用的測量選項，最常用的測量有：area面積density（mean）平均光密度diameter直徑IOD（integrated optical density）累積光密度在相應(yīng)的項目上點一下，該測量項目就被選到中間的窗口中了，同時關(guān)于該測量的詳細說明會顯示在最右邊。前者是這個calss中每一個object的測量數(shù)據(jù)，后者是這些測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計參數(shù)，如總數(shù)、平均值、累加、標準差等。只要在數(shù)據(jù)菜單中點file DDE to EXCEL。訂正：在上述操作中漏掉了一個重要步驟，就是要轉(zhuǎn)換圖象intensity格式。轉(zhuǎn)換光密度單位的方法如下：點擊：measurecarliberationintensity，調(diào)出intensity校正窗口。這樣就把程序系統(tǒng)的灰度單位轉(zhuǎn)換成了光密度單位。整個分析測量過程就是這樣。此主題到此結(jié)束。 我們先看irregular工具。這個工具的標題叫Magic wand，就是photoshop中的魔棒呀。在一個區(qū)域上多點幾下，就能選中這個區(qū)域的整個邊界了。一般不需要平滑，因此默認值為零選中一個區(qū)域后如果還要在同一張圖片上再選另一個區(qū)域，不能直接點選，要先點擊一下工具欄上的Multiple AOI按紐，再點擊add，接下去就可以到另一個選擇區(qū)域點選。 這個irregular工具還有另一個操作方式，在問號旁邊有個trace按紐，點一下它，工具條就變成另一個樣子了。用鼠標畫當(dāng)然是不會準確的。這樣就自動圍成了一個閉合區(qū)域，點一下右鍵就確認了這個AOI。這時就要及時先點一下鼠標使光標暫停下來，然后在期望的方向延長再點一下左鍵，給程序指明一下前進的方向，如此多次，直到光標回到起點為止。選好了一個個的AOI后當(dāng)然是要測量每個區(qū)域的幾何尺寸及光密度啦。在count/size窗口右邊有一個option按紐，點開它就能設(shè)定object標記的外觀了。右上角還有一個class的顏色選擇按紐，估計大家自己試一下都會用的。然后是OK按紐關(guān)閉measure窗口，點開view菜單下的measurement date和statistics數(shù)據(jù)窗口。前面討論的主要是irregular工具，它對于大個的孤立圖形對象的選取是有用的，而面對組織切片中密密麻麻的細胞，就得用本主題討論的segmentation工具了。讓我們還是從打開圖片并調(diào)出count/size窗口開始吧。我們要選取后者，并且使用HSI顏色格式來進行分色選擇。S為色飽和度，I為強度。色飽和度S與強度I都直接設(shè)為0255?；氐絚ount/size窗口，按count紐，也一樣不好用?。?！或者點count后計算的區(qū)域根本就不是剛才選取的正確區(qū)域。圖片中被選中的區(qū)域有許多很小的選點，顯然這是各種雜質(zhì)，并不是成片的蛋白表達區(qū)域。對area來說，默認值一般是0，意思是不管區(qū)域有多小，都被計入測量范圍內(nèi)。把那些通過顏色選擇不能排除的object給進一步排除掉。 凡是玩電腦都必會有一個reset鍵。在選文件夾與word的edit菜單里都有這項功能。盡管幫助文件是英文的，看起來有點困難，但中文的幫助文件翻譯得不準確，有時比英文的還難懂呢。在segmentation窗口的下方還有一些有用的功能。如果把一部分選成black，其效果就等于把這一部分從圖象中摳去，這個處理也是很有用的。在處理一組多個圖片的時候，不能每個圖片都選擇一次顏色，這樣各個圖片的選擇標準不一致，而且費時間。請繼續(xù)閱讀下一主題。但是當(dāng)你作了兩組實驗動物，每組5只，每只動物切出來五張組織切片，每張切片選取了5個視野拍下了照片，這就一共有2*5*5*5=250張照片。例如：一大批圖片，需要把它們的象素調(diào)整到一個較小的值以便上傳到網(wǎng)上。對于分析免疫組化圖片這樣的復(fù)雜操作，制作一個宏來進行分析，節(jié)省下來的時間就更可觀了。class object 標記為標記class顏色，組織空白區(qū)域較亮的地方為背景區(qū)域。在編制宏操作時，因為是自動操作，所以不能有人工選擇干預(yù)的操作動作。，選好陽性表達區(qū)域的分色后，點擊下面file中的save file，把這個分色設(shè)定也保存成一個文件，也起一個有意義的英文文件名。設(shè)置一下測量數(shù)據(jù)傳往Excel的規(guī)則，這很重要。里面是Excel程序的文件位置，好長呢，別動它。position data set row 1 col 1 這是指定數(shù)據(jù)從Excel表單的具體哪個位置開始放，現(xiàn)在的行列值都是一，就是左上角。append next date set to the right 下一組數(shù)據(jù)放在前一級數(shù)據(jù)的右邊。設(shè)定了DDE option后，不要關(guān)閉statistics窗口。，打開count/size窗口，還有空著的statistics窗口。名字得是八個字母的英文名。，一步也不能操作錯喲，否則你的錯誤操作會被記錄在案，并且在每次運行宏操作時都重復(fù)這些錯誤。 color 調(diào)出segmentation窗口。 to Excel。每次處理圖片時任何窗口都不必打開，只要打開圖片，按一下宏運行的快捷鍵ctrl A。幾秒鐘宏運行結(jié)束后再處理下一張。宏錄制錯了想修改能作到嗎？當(dāng)然能，但你得會編程語言。分析目標是每張片子中各個細胞的蛋白表達強度，也就是其“黃色”的深與淺。就是那個正圓的AOI選擇按紐。，把這個圓轉(zhuǎn)換成一個object。調(diào)出測量數(shù)據(jù)顯示窗口和測量值統(tǒng)計數(shù)據(jù)窗口，現(xiàn)在可以看到第一個細胞的測量數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示出來了。我們就把這個重復(fù)動作編成一個宏，把這步操作簡化到兩步：用鼠標移園圈到下一個細胞，按一下宏快捷鍵。調(diào)出record macro窗口，起個名字叫test1，定義其快捷鍵為ctrl D，用ctrl B可以嗎？當(dāng)然可以，但B在鍵盤中間，同時按ctrl 與B鍵是不是挺累手的？點OK后記錄的操作動作很簡單： AOI to object AOI點stop recording macro結(jié)束。數(shù)數(shù)你得點多少下鼠標。一個細胞一秒鐘就搞定。還有個招就是把一組照片全部同時打開，測量一個圖關(guān)閉一個圖，直到最后一張。計數(shù)其實在前面的操作中，我們經(jīng)常是在計數(shù)。因為沒作過具體的計數(shù)分析，因此這一主題寫起來就有點尷尬了。當(dāng)圖片中的細胞數(shù)目多得一眼看不出有多少個，但同時也不是多得密密麻麻的時候，比如幾十個吧，用這招最簡單。所以選擇計數(shù)測量時可以讓電腦自動選取亮物體作為識別標志。圖片中的細胞都有一定大小，那些只有幾個像素的小綠點顯然不是一個細胞。此表的橫坐標數(shù)是面積的象素值，縱坐標是對應(yīng)像素值面積有多少個object。圖中可以看到，如果把面積下限定到100象素，就只剩下16個細胞了。而另外還有細胞因為太暗，被識別成兩個甚至更多的object了。split是手工分割，點此后出現(xiàn)一個小窗口，用鼠標在相連的兩個object的連接處劃一條短線，將兩個分開，再點一下右鍵就行了。這種分割方法是半自動的。以便分割得更準確。這跟split的操作類似，只是不劃線，而是畫一個圈，把幾個本應(yīng)在一起的Objects圍起來就行了。class的意思就是分類。具體作法大家當(dāng)作作業(yè)自己試試吧，我是用吸管工具來選色的，這張圖片大家很熟悉吧？里面有紅綠兩種顏色的細胞，可以用分類計數(shù)的方法同時對兩種細胞進行計數(shù)。如果你想用IPP來進行細胞計數(shù)的話，一定要照下清晰干凈的照片再來處理。而且不會因為你關(guān)閉程序或關(guān)閉電腦就能Reset了。 還有一個需要標定的是光密度，這可就比幾何標尺困難多了。 標定標尺還需要有個物質(zhì)準備，就是得有一個叫“微標尺”的小玻璃片。照理說如果有一個能放在載片上的尺寸已知的小東西也是可以的，這個東西首先得足夠小，其次得準確知道它的尺寸。上面說的是使用顯微鏡照片時用的標尺。在IPP中，程序先記住1MM相當(dāng)于多少象素，然后測量樣品圖象的幾何尺寸時只要先算出象素值，一換算就得了。可以分別用這些物鏡拍攝下不同的微標尺圖象，在處理不同物鏡下拍攝的照片時使用各自對應(yīng)的標尺。如果你的像機是非變焦鏡頭，還不錯。數(shù)字變焦不予考慮。分別是低、中、高三個檔次。我偷懶，只拍攝4種鏡頭下各自的標尺照片，相機變焦與象素選擇都只用一種。1點擊菜單中的new按紐。別用中文字符。 when change unit選項，給勾上。另一個方法是把標尺的兩端放在短刻線的線頭處，這樣選點更準確。，數(shù)一下兩個端點之間有多少間隔，這個微尺每格10um，兩端點間為二十小格，長度為200um，所以要在scaling里填上200。如果你覺得這個標尺作得不對，得重作，可以重新打開窗口，在Name中選出這個標尺，點image重新找端點。窗口下面的幾個選項都不要動它，保留默認值。 carlibration select spatial。再點擊marker按紐（不是點OK按紐）。具體方法下兩帖單獨講。，就消不掉了，所以標記上標尺的圖片最好另存一張。它的位置就是上次選標尺的位置。至此就永久地標上了小標尺了。點OK進入下一步。標尺和文字都拖到位后再點continue，一旦點了continue就不能后悔了。IPP的標尺功能好象有點BUG，有時候真的不靈。如果你在IPP中設(shè)定了標尺，就一定要設(shè)對，否則所有的計算結(jié)果都是錯誤的換算數(shù)據(jù)。設(shè)定了標尺后，幾何測量值就不是象素值，而是換算成微米值了。本主題到此結(jié)束。定義標尺與在圖片上打上標尺記號是兩回事。在那個select measurement窗口中除了一些光密度測量