【正文】 然后到你自己的電腦上按照這個(gè)路徑看看。Media Cybnetics公司的軟件工程師注意到了很多人都在使用IPP測(cè)量免疫組化圖片的光密度，也注意到了論壇上大家討論的分析免疫組化圖片的方法，于是他們給大家編制了一個(gè)macro，專門(mén)用來(lái)方便地進(jìn)行免疫組化圖片的分析，這可是專業(yè)水平的macro，真管用呀。 自從寫(xiě)了imagepro plus教學(xué)系列帖子“手把手教你使用IPP”以來(lái)，得到了不少好評(píng)。，再關(guān)閉掉上一張圖片。 DDE to Excel。，再點(diǎn)程序菜單上的editconvert to gray scale8?，F(xiàn)在桌面上有光密度較正窗口、count窗口，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)值窗口和圖片窗口，以此為運(yùn)行宏的開(kāi)始。一句話，測(cè)量的IOD是分子的值，一般情況下都相似，選擇的area這個(gè)分母在不同的切片上卻各有不同，需要看切片的具體情況進(jìn)行適當(dāng)選擇。使用的測(cè)量指標(biāo)應(yīng)該是切片的平均光密度，計(jì)算方法為IOD/（照片面積空白區(qū)域面積）照片面積就是照片的象素，一張480*720象素的照片面積是345600。現(xiàn)在我們測(cè)量的是整張照片中黃色區(qū)域的總光密度值。這實(shí)際上就是扣背景了。然后也要保存顏色設(shè)置文件。所以可以選用IOD與area兩個(gè)測(cè)量項(xiàng)目。白色的背景能達(dá)到250左右，而拍得較暗的照片或者背景偏藍(lán)的照片則只有200甚至更低。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動(dòng)白平衡在起作用。拍照也是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在顯微鏡下拍攝免疫組化照片需要注意以下幾個(gè)要點(diǎn)： ，在更換樣品時(shí)，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動(dòng)！所有的樣品必須一次拍攝完全。自動(dòng)白平衡功能對(duì)熒光照片的影響特別大?？墒怯萌玖先旧娘@微鏡照片就偏偏都是有偏色的。因?yàn)椴噬珗D片的density mean與灰度圖片的density mean應(yīng)該是一樣的。如果各張照片的亮度差別大，就得分別較正每一張照片的“白點(diǎn)”了。結(jié)論是兩組照片有顯著性差異。2a 400 density mean = IOD sum = 24721144 陰性3a 400 density mean = IOD sum = 18576882 陰性4a 400 density mean = IOD sum = 16926544 陰性4b 400 density mean = IOD sum = 19494658 陰性 1a 400 density mean = IOD sum = 陽(yáng)性1b 400 density mean = IOD sum = 陽(yáng)性1c 401 density mean = IOD sum = 陽(yáng)性1d 401 density mean = IOD sum = 陽(yáng)性點(diǎn)intensity旁邊的image按紐，到圖片上最“白”的地方點(diǎn)一下，看看值是多少，最好在一組照片的每一張最白處都點(diǎn)一下，看看它們的值相差多少。不作也罷?；蛘哂脴?biāo)準(zhǔn)樣品的光密度點(diǎn)直接定義其為樣品濃度的值。我們進(jìn)行光密度校正的目的就是讓照片上亮的、白的、染色淺的點(diǎn)的OD值顯示為接近于零的小的數(shù)值，讓暗的、黑的、染色深的陽(yáng)性區(qū)域點(diǎn)的OD值顯示為較大的數(shù)值。IOD的數(shù)值與染色深淺就成了負(fù)相關(guān)，也就是染色越深，IOD反而更小，但同時(shí)，面積越大，IOD仍然越大，這個(gè)錯(cuò)誤的IOD值就根本不能反映“照片上陽(yáng)性物質(zhì)總量”了。對(duì)應(yīng)照片上最黑的部位，gray=0 在未進(jìn)行intensity校正的情況下，IPP用的是gray灰度單位。純白點(diǎn)的“亮度”為255。真的很傷腦筋，其中有些問(wèn)題也是百思不得其解。在熒光拍攝中，還有用CCD拍攝熒光單色照片，然后再合成的作法。2. all按紐點(diǎn)一下，選用所有這些照片來(lái)合成一張清晰照片。照下第一張照片。最適于對(duì)電泳圖片作這樣的處理，哪有條帶能看得一清二楚。其中有一些還是銷(xiāo)售人員用來(lái)炫耀軟件好處的呢。這些照片的背景是淺藍(lán)色的，說(shuō)明照片拍得還不夠理想。正常組也有黃色區(qū)域，與一天組、三天組之間，IOD沒(méi)有顯著性差異。也許還是舉個(gè)例子來(lái)討論一下分析策略吧。作切片時(shí)要保證各個(gè)切片條件的一致就不說(shuō)了，在使用數(shù)碼相機(jī)拍攝切片照片時(shí)得注意什么呢？。比如免疫組化染色圖片的圖象分析方法，查過(guò)一些文獻(xiàn)，提到圖片的數(shù)字分析處理時(shí)往往就幾句話。右邊顯示的測(cè)量數(shù)值也可以傳到Excel。量角度的兩個(gè)工具有啥區(qū)別?前一個(gè)畫(huà)著角線的工具是讓你在圖上自己畫(huà)兩條直線，測(cè)其角度。我挑幾個(gè)有意思的說(shuō)說(shuō)。你們是否注意到，所有這些幾何測(cè)量項(xiàng)目都有一個(gè)共同的因素都是測(cè)量一個(gè)區(qū)域的幾何尺寸。關(guān)于與光密度校準(zhǔn)相關(guān)的操作，將在另外的主題中討論。而且IPP的記性非常好，即使你關(guān)閉程序了，關(guān)閉電腦了，它還是記得你設(shè)置了一個(gè)標(biāo)尺，下回你使用IPP時(shí)它還是自動(dòng)地應(yīng)用這個(gè)標(biāo)尺，所以每次開(kāi)始使用IPP的時(shí)候，一定要點(diǎn)一下工具欄里的卡尺按紐，選擇一下標(biāo)尺，如果不想應(yīng)用標(biāo)尺，就一定要選none。回到選擇窗口后點(diǎn)OK關(guān)閉。如果作錯(cuò)了哪一步想從頭來(lái)，得先關(guān)閉圖片（一定要選擇不保存），關(guān)閉全部窗口，再重新來(lái)一遍。！切記切記！否則長(zhǎng)度肯定會(huì)標(biāo)錯(cuò)的。這回彈出的是spatial calibration marker窗口。那些是較正圖象變形用的。，回到spatial carlibration窗口。，就立即彈出scaling對(duì)話框，同時(shí)在標(biāo)尺圖片左上角顯出一個(gè)標(biāo)尺，將鼠標(biāo)移到這個(gè)標(biāo)尺的橫杠上，點(diǎn)一下左鍵，光標(biāo)就立即變成了小手，就用這個(gè)小手把光標(biāo)拖下來(lái)，再將光標(biāo)分別移到移到橫杠的左右兩端，用左鍵拖這兩個(gè)端點(diǎn)到圖片兩邊的標(biāo)尺該線處。新建一個(gè)標(biāo)尺，然后再最上面Name項(xiàng)下的spatial cal 0處點(diǎn)一下，改成40XlowR。三種象素畫(huà)面大小是不同的，因此也要分別拍攝它們的標(biāo)尺圖片。不用管變焦的事。 最重要的一點(diǎn)就是，現(xiàn)在的數(shù)碼相機(jī)都有無(wú)級(jí)變焦，可以任意放大縮小畫(huà)面。我現(xiàn)在能夠想到的東西就是血球計(jì)數(shù)板。對(duì)光密度進(jìn)行標(biāo)定我覺(jué)得麻煩而且不準(zhǔn)確，在實(shí)際應(yīng)用中我們一般都只測(cè)量相對(duì)的光密度對(duì)比，因此對(duì)光密度進(jìn)行標(biāo)定實(shí)在是吃力不討好的事。否則會(huì)累死你。但前提是照片中的兩類細(xì)胞得有明顯的區(qū)別，比如顏色不同、大小不同或亮度不同。按照說(shuō)明書(shū)的意思，需要輸入的數(shù)值是漲水最多淹沒(méi)多少象素的數(shù)值。把圖片上所有相連的object全分割后再點(diǎn)一下小窗口的OK按紐。當(dāng)調(diào)整過(guò)濾數(shù)值時(shí)，圖片上的object標(biāo)志也會(huì)動(dòng)態(tài)地顯示，過(guò)濾掉的object會(huì)立即消失。因此可以對(duì)每個(gè)object的面積大小進(jìn)行過(guò)濾，小于一定面積的就不是一個(gè)細(xì)胞。好象這樣計(jì)數(shù)不正規(guī)呀，最好是電腦點(diǎn)一下就能算出數(shù)來(lái)是最好的。當(dāng)我們點(diǎn)擊count的時(shí)候，就是在計(jì)數(shù)，不過(guò)當(dāng)時(shí)的主要目的不是為了計(jì)數(shù)，而是為了進(jìn)行一些其他的測(cè)量。一張圖也就十來(lái)秒吧？操作完一張圖后，把數(shù)據(jù)傳到Excel中。這就完了？完了。 AOI，剛才那個(gè)正圓又會(huì)露出來(lái)了，用鼠標(biāo)直接將它移到另一個(gè)細(xì)胞上面，再點(diǎn)一下convert AOI to object，就出來(lái)第二個(gè)object了。在圖片上畫(huà)一個(gè)比細(xì)胞稍小的正圓（差不多就可以不必是完全準(zhǔn)確的正圓）。我不會(huì)，只好刪除掉錄錯(cuò)的然后重新錄制宏。只見(jiàn)屏幕一閃一閃地，幾秒種，測(cè)量數(shù)據(jù)就在Excel里了。 color。點(diǎn)完OK后，宏記錄的窗口停在屏幕右下角，當(dāng)你記錄完所有宏操作后，點(diǎn)其中的stop recording就記錄完成了。 Macro，就調(diào)出來(lái)了錄制宏的開(kāi)始窗口。imcrement position for naxt date set by row __ col ___ 這個(gè)更靈活，只要填上幾行幾列，下一組數(shù)據(jù)就移動(dòng)幾行幾列存放。sheet：Active sheet。存完后重新選擇背景的分色，再把背景分色設(shè)定也保存成一個(gè)文件。選完分色后點(diǎn)count，在statistics窗口中把統(tǒng)計(jì)數(shù)值傳入Excel中。首先是在所有待處理照片中挑選一張有代表性的典型圖片，進(jìn)行仔細(xì)的選色及分析測(cè)量。如果你用IPP處理一張照片用時(shí)兩分鐘，就一共需要500分鐘=8小時(shí)。先處理一張典型的圖片，把顏色選擇參數(shù)保存成一個(gè)文件，在處理下一張圖片時(shí)，只要把這個(gè)文件再調(diào)出來(lái)就行了。在priview框中，上面一個(gè)選項(xiàng)是對(duì)選擇的區(qū)域標(biāo)注ckass顏色的，可以選擇不標(biāo)色，只標(biāo)當(dāng)前class顏色（current class）或者所有class顏色。segmentation里也有這個(gè)喲。類似的測(cè)量選項(xiàng)還有Radius Ratio等，通過(guò)這些測(cè)量值的過(guò)濾，可使得AOI選得更加準(zhǔn)確。對(duì)這些雜質(zhì)小點(diǎn)有一個(gè)有效的方法來(lái)去除，就是測(cè)量過(guò)濾（filter）。這就是說(shuō)，只要是黃色，就被認(rèn)為是陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域。當(dāng)切換到HSI時(shí)，會(huì)彈出一個(gè)窗口提示你會(huì)reset顏色選擇，是否繼續(xù)？當(dāng)然是OK啦。實(shí)際上，在第一部分入門(mén)中所用的就是segmentation工具，在那里我用顏色吸管選取了圖片中藍(lán)色的細(xì)胞核，但是如果仔細(xì)觀察一下選取的效果就會(huì)發(fā)現(xiàn)，有一些挨在一起的兩個(gè)以上的細(xì)胞核被識(shí)別成了一個(gè)，另有一些藍(lán)色的雜質(zhì)顆粒被錯(cuò)誤地識(shí)別成了細(xì)胞核。 下一步是點(diǎn)measure菜單下的select measurements。下面該怎么作呢？點(diǎn)開(kāi)count/size窗口，點(diǎn)菜單EDITconvert AOI to Objects。重復(fù)選取多個(gè)AOI的方法與樓上一樣。這種操作方式是沿著孤立圖像的邊緣尋跡，從而畫(huà)出一個(gè)沿著孤立形狀邊緣圍成的一個(gè)AOI。最后點(diǎn)一下右鍵，就確定了一個(gè)不規(guī)則形狀的選定區(qū)域。 這是一個(gè)用來(lái)描繪不規(guī)則孤立對(duì)象邊界的工具。當(dāng)然，光知道這一點(diǎn)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。然后在窗口中點(diǎn)new按紐，再點(diǎn)一下下面的std optical density選項(xiàng)，這時(shí)可以看到窗口中的直線變成了反向的曲線。數(shù)據(jù)就傳到EXCEL的sheet1里去了。如果想取消某個(gè)已選中的測(cè)量項(xiàng)目，則在左邊窗口中該項(xiàng)目上再點(diǎn)擊一下就可以了。點(diǎn)一下吸管圖標(biāo)，在目標(biāo)區(qū)域點(diǎn)一下，就可以選中該點(diǎn)的顏色，當(dāng)然一下是不可能完全選中所需要指定的全部區(qū)域，可以在未選中的地方接著再點(diǎn)，這樣多次選取，直到把想選中的區(qū)域全部選中為止。所以首先要把圖片中呈現(xiàn)黃色的區(qū)域給挑選出來(lái)，這部分區(qū)域是我們最感興趣的地方，叫作AOI（area of interest）。本人使用該程序進(jìn)行生物圖象分析有一段時(shí)間，寫(xiě)此帖的主要目的還是與大家交流使用心得，并總結(jié)一下使用方法。打開(kāi)IPP后的界面是這樣的，該從何處下手呢？既然是處理圖片，當(dāng)然是先要打開(kāi)一張要處理的圖片嘛這張照片中的黃色部分是免疫組化染色的陽(yáng)性表達(dá)成分。點(diǎn)擊measurecount/size,彈出分類測(cè)量窗口。以此圖為例，圖中深藍(lán)色的部分是細(xì)胞核，因此所有的細(xì)胞核都被選中成一個(gè)class，其中每一個(gè)細(xì)胞核就是一個(gè)object。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)則可得到這張圖片中所有細(xì)胞核的平均面積、平均光密度值，平均直徑、累積光密度值，當(dāng)然還有細(xì)胞核的數(shù)目，就是所有object的數(shù)目。而實(shí)際上我們測(cè)量的染色強(qiáng)度是光密度，染色越深，光密度值越大。校正光密度單位的操作要在打開(kāi)第一張圖片后立即進(jìn)行。 在IPP中，最有特色，最有用處的工具有兩個(gè)。這里“相似”的定量范圍由Range的值來(lái)決定。最后在圖片上任一處點(diǎn)一下右鍵結(jié)束選擇操作。第二種方法是自動(dòng)尋跡。圍好的AOI邊界是綠色框。label style 可以選擇為object序號(hào)或測(cè)量值。如果你還想繼續(xù)增加objcet，可以直接用irregular工具畫(huà)AOI，然后點(diǎn)convert AOI to object。選manual，并點(diǎn)select color調(diào)出segmentation窗口。點(diǎn)一下H，直方圖顯示就是圖片各象素H值的分布，在直方圖的兩邊各有一根線，這就是選擇線，先將右邊的線用鼠標(biāo)左鍵向里面拉，拉一點(diǎn)停一下看看效果，可以看到最開(kāi)始時(shí)是選中了全部畫(huà)面，然后是藍(lán)色的區(qū)域慢慢顯露出來(lái)，并且越顯越多，選擇線的位置也在下面的窗口中有顯示，是0255之間的數(shù)，共有兩個(gè)窗口，左邊是取值下限，右邊是取值上限，先不斷減小上限值使得非黃色區(qū)域不斷地顯露出來(lái)，再不斷增加下限值讓另一部分非黃色的區(qū)域也顯露出來(lái)。這樣操作結(jié)束后仔細(xì)觀察一下計(jì)算的區(qū)域，正是剛才正確選取的區(qū)域了。改完后點(diǎn)一下旁邊的Filter按紐，再點(diǎn)measure按紐，或者回到count/size窗口內(nèi)把Apply Filter Ranges in Range前面的選項(xiàng)給勾上，再點(diǎn)count按紐，這回就把小雜質(zhì)點(diǎn)全給過(guò)濾掉了。選AOI也是這樣，如果選得不合心意，想全部重新來(lái)的話，按count/size窗口中的delete鍵，就可以把剛才作的一切都給全部推倒重來(lái)了。另一種是在Histogram Based 模式中利用HSI范圍來(lái)選取目標(biāo)顏色。窗口最下方的file按紐是用來(lái)保存顏色選取參數(shù)的。實(shí)際上宏不過(guò)是把一連串的操作集合到一個(gè)操作的有效工具。蛋白表達(dá)區(qū)的HSI分色數(shù)值為H：028，S與I都是0255。宏操作前的準(zhǔn)備：，（包括select measurement、class option設(shè)置）點(diǎn)擊file菜單的 save settings 將這些設(shè)置保存成一個(gè)文件，保存位置最好放在與待處理圖片一起的文件夾中。在DDEoption窗口中從上到下需要填的選擇是：target program：Excel 這是廢話，不必改，就這樣了。如果想讓數(shù)據(jù)重新從左上角開(kāi)始填，那就必須把這個(gè)行列值給改回1。這樣DDE的設(shè)定就不會(huì)悄悄地變化了。用與ctrl或shift位置較近的字母如ASZXWQ或OPLKM之類。，計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)會(huì)馬上顯示在statistics窗口中。有兩個(gè)delete動(dòng)作是不是有點(diǎn)多余？不，它可以節(jié)省宏運(yùn)行時(shí)間的。二百五十張圖片一會(huì)就處理完了。對(duì)這張圖片中的所有細(xì)胞都這么測(cè)一遍，求其平均值。注意：不能點(diǎn)count/size菜單中的count按紐。再處理下一張圖片。得花幾秒鐘吧？如果用宏操作。關(guān)于宏的討論到此結(jié)束。最簡(jiǎn)單的數(shù)細(xì)胞的工具是measuremeasurement窗口，下圖中左邊紅線框住的工具就是計(jì)數(shù)的工具。調(diào)出statistics窗口就可以看到自動(dòng)計(jì)數(shù)結(jié)果了。再下面是統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，可以動(dòng)態(tài)地看到過(guò)濾后的