重組水蛭素的聚乙二醇修飾(編輯修改稿)
2025-07-19 08:23 本頁面
【文章內容簡介】 phase assisted PEGylation reaction mixture ( 20mM , rHir: SCmPEG=1:3 )圖6 固相修飾反應混合物( 20mM PBS,rHir:SCmPEG=1:3)的純化產物的電 泳圖譜Fig. 6 SDSPAGE analysis of the separation products of the solidphase assisted PEGylation reaction mixture ( 20mM PBS, rHir: SCmPEG=1:3 )如圖5所示，峰1為鹽濃度突然增大造成的紫外吸收的波動，峰2經電泳檢測,如圖6所示，分子量為約27KDa，推斷為單修飾產物，峰3經高效凝膠過濾檢測，因其具有和標準重組水蛭素相同的洗脫體積，推斷其為未反應的水蛭素。 His修飾位置異構體含量測定利用中性羥胺法對修飾位置異構體的含量進行檢測。圖7 固相輔助單修飾產物高效凝膠過濾圖譜Fig. 7 HPSEC analysis of the monoPEGylated product of the solidphase assisted PEGylation由圖7可知，中性羥胺作用未能打開mPEG與重組水蛭素之間的連接鍵，所以修飾反應未發(fā)生在His51。重組水蛭素中其他可能與mPEGSC發(fā)生修飾的氨基酸殘基主要是Lys的ε氨基，N末端氨基，文獻報道N末端氨基的pKa ，而Lys的ε 氨基的pKa [10]，由于隨著pH的降低，N末端氨基的反應活性將大于Lys的ε 氨基[11,12]， ，其反應活性較高，故推測修飾反應發(fā)生在N末端氨基。 采用凝血酶滴定法對修飾產物進行活性檢測。表2 凝血酶滴定法測固相輔助單修飾產物活性Table 2 Analysis of the monoPEGylated product of solidphase assisted PEGylation by thrombin titration method由表2知，單修飾產物的抗凝活性為原蛋白（rHir）%。該修飾產物的活性保留率略高于液相修飾反應所得單修飾產物的活性（34%），,%的單修飾產物的修飾位點為組氨酸殘基，而相同反應條件下的固相輔助修飾的單修飾產物的修飾均未發(fā)生在組氨酸，這是兩種單修飾產物活性差異的主要原因。 水蛭素Lys位點的PEG修飾 液相修飾產物的分離純化采用離子交換柱對SCmPEG 20 kDa的修飾產物進行分離純化、SDSPAGE法對分離組分進行鑒定。圖8 SCmPEG 20kDa液相修飾產物離子交換色譜圖Fig. 8 Ion Exchange Chromatography of the SCmPEG 20kDa HV 2 prepared in solution phase 圖9 SCmPEG 20kDa液相修飾產物離子交換洗脫物電泳圖 SDSPAGE of peaks collected from 結合表圖9可知，圖8中峰 1, 2分別為二修飾和單修飾產物。通過積分法計算出圖8中各峰的面積，從而得出各產物的比例：峰1:峰2= %:%，可見單修飾產物是主要的修飾產物。 “離子交換柱輔助”的固相修飾產物的分離純化對用“離子交換柱輔助”的固相修飾方法得到產物，采用階段洗脫的策略進行分離、SDSPAGE法進行組分鑒定。圖10 SCmPEG 20kDa固相輔助修飾產物離子交換色譜圖 Ion Exchange Chromatography of the SCmPEG 20kDa HV 2 on column modification圖11 SCmPEG 20kDa固相輔助修飾產物離子交換洗脫物電泳圖Fig. 11 SDSPAGE of peaks collected from 。圖10中峰1，2分別為SCmPEG 20kDa二修飾和單修飾產物。通過積分法得出圖10中各產物的比例：峰1：峰2= %：%。相比液相分離在純度及修飾專一性上都有了顯著提高。但從圖11比較中發(fā)現固相修飾的轉化率比液相要低。這可能是由于固相修飾中，柱內填充著的離子交換介質導致環(huán)境復雜，蛋白和PEG在水溶液中狀態(tài)以及分子大小差異使得它們在柱中的分配不同，致使反應物接觸幾率降低。 修飾產物體外抗凝活力測定采用凝血酶滴定法對修飾水蛭素進行活性檢測。圖12 各種單修飾水蛭素體外比活Fig. 12 The specific activity ratios of the monoPEGylated HV2s in vitro圖12所示，固相修飾的蛋白活力保留率顯著高于液相修飾。固相修飾提高修飾反應的單一性，且活力保留率比較高。此種現象從另一個角度說明固相修飾可以提高修飾專一性。 采用溶劑可及表面積法對水蛭素修飾位點預測發(fā)現：在液相修飾中除Lys47外其它三個賴氨酸的NH2殘基都比較容易被修飾；在固相修飾中，Lys 27， Lys 35比Lys 24， Lys 47更易被
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