靈芝多糖拮抗前列腺素e2對(duì)小鼠脾細(xì)胞ifn-γ和tnf-α(編輯修改稿)
2025-07-17 07:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 R循環(huán)儀中反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)如下：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60 min，然后94 ℃終止反應(yīng)5 min。PCR擴(kuò)增PCR引物采用在線軟件Primer3進(jìn)行設(shè)計(jì)。小鼠IFNγ上游引物：539。ttt gag gtc aac aac cca ca339。，下游引物：539。cgcaat cac agt ctt ggc ta339。，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為388 bp。小鼠TNFα上游引物：539。agt ccg ggc agg tct act tt339。，下游引物：539。gca cct cag gga aga gtc tg339。，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為422 bp。小鼠βactin上游引物：539。cca gag caa gag agg tat cc339。，下游引物：539。ggg gtg ttg aag gtc tca aa339。，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為216 bp。 PCR操作如下：在PCR PreMix 管中加入消毒雙蒸水8 μl，被檢測(cè)基因mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或內(nèi)參βactin mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，相應(yīng)的上、下游引物各5μl(15 pmol)，振蕩混勻，加石蠟油15 μl，快速離心數(shù)秒， 置PCR循環(huán)儀中反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)如下： 94 ℃ min，然后進(jìn)入以下28個(gè)循環(huán)：94 ℃變性45 s，57 ℃退火1 min，72 ℃ min。循環(huán)完畢，72 ℃延伸5 min。半定量分析取被檢測(cè)基因和βactin RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠(含EB %)梳孔中，TBE電泳緩沖液，在3 v/cm電壓條件下電泳50 min。將凝膠轉(zhuǎn)移至凝膠分析系統(tǒng)暗箱中，在紫外線照射下測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度值。結(jié)果表示為：(被檢測(cè)基因擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度值247。相應(yīng)βactin擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度值)100%。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組間顯著性差異采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)。2結(jié)果PGE2對(duì)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)(MLR)中IFNγ mRNA表達(dá)的抑制作用不同濃度PGE2連續(xù)作用4 h后，MLR中小鼠脾細(xì)胞IFNγ mRNA表達(dá)受到不同程度的抑制，隨著PGE2濃度的增加，抑制作用不斷增強(qiáng)。PGE2濃度在10 μmol/L以上時(shí)與空白對(duì)照組比較，其抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P，n=5，圖1)，半效抑制濃度約為20 μmol/L。因此，選擇20 μmol/L的PGE2作為抑制模型的造模濃度。靈芝多糖拮抗PGE2對(duì)MLR中脾細(xì)胞IFNγ mRNA表達(dá)的抑制作用在MLR中，固定PGE2濃度為20 μmol/L，在其中再加入不同濃度的靈芝多糖(100或200 mg/L)，觀察靈芝多糖對(duì)PGE2的拮抗作用。培養(yǎng)4 h后，靈芝多糖(200 mg/L)明顯促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞IFNγ mRNA的表達(dá)，而PGE2(20 μmol/L)呈明顯的抑制作用(P，n=5)。當(dāng)靈芝多糖為100和 200 mg/L時(shí)可部分對(duì)抗PGE2(20 μmol/L)對(duì)IFNγ mRNA表達(dá)的抑制作用(P，P，n=5，圖2)。 圖1 PGE2對(duì)小鼠混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)中脾細(xì)胞IFNγ mRNA表達(dá)的抑制作用 PGE2 inhibits murine splenocyte IFNγ mRNA expression in mixed lymphocyte culture reaction (MLR)1: Control。 2: PGE2 (5 μmol/L)。 3: PGE2 (10 μmol/L)。 4: PGE2 (20 μmol/L)。 5: PGE2 (40 μmol/L)。 **P vs control。 A: A representative gel electrophoretogram of 5 experiments. B: Percentages of IFNγ mRNA PCR product relative to that of βactin by digital gel image analysis.圖2靈芝多糖拮抗PGE2對(duì)小鼠混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)中脾細(xì)胞IFNγ mRNA表達(dá)的抑制作用Ganoderma polysaccharides (GLB) antagonize PGE2induced inhibition of murine splenocyte IFNγ mRNA expression in MLR1: Control。 2: GLB (200 mg/L)。 3: PGE2 (20 μmol/L)。 4: PGE2 (20 μmol/L)+GLB (10
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