【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 0 ng/ml)著色20分鐘。然后在室溫下細(xì)胞又在PBS中用2%FBS洗滌就會(huì)逐步產(chǎn)生抗鼠IgGRPE二抗然后用二脒基苯基吲哚作用20分鐘。作為陰性對(duì)照，將不含初級(jí)抗MET抗體的細(xì)胞進(jìn)行染色。質(zhì)膜結(jié)合的蛋氨酸的熒光強(qiáng)度（AU為單位），通過使用GraphPad Prism軟件繪制為箱形繪圖圖表。EBC1 WT 細(xì)胞能穩(wěn)定地在兩種不同量的慢性病毒顆粒編碼的MET cDN轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括1mg(MET254。254。)(MET254。254。254。)的p24病毒抗原，其濃度按說明確定。作為對(duì)照，WT細(xì)胞用含有空載體病毒顆粒感染 。MVDN30抗性細(xì)胞(R20 and R80)只用空載體感染。在感染48小時(shí)后接種細(xì)胞用于生物化學(xué)分析。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的可行性分析如先前描述的一樣進(jìn)行，讓細(xì)胞在存在或不存在MVDN30的條件下上長(zhǎng)72小時(shí)。如先前所述，MET的蛋白印跡分析和磷酸化的MET蛋白水平和對(duì)感染細(xì)胞的mRNA的表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR分析一樣子細(xì)胞感染72小時(shí)后進(jìn)行評(píng)估。. 藥物協(xié)同作用分析在抗MET抗體MVDN30和MET TKI JNJ38877605之間進(jìn)行藥物協(xié)同作用分析是對(duì)WT EBC1和接種在96孔板上的GTL16細(xì)胞在用藥物治療72小時(shí)后的細(xì)胞活力的研究。如果使用一個(gè)藥品從藥物劑量來說要比混合使用的IC50約高10倍左右，雙重增加濃度可以用于單藥使用和組合使用。評(píng)估細(xì)胞活力為前面描述的增效作用的藥物效應(yīng)多種分析研究，采用組合指數(shù)（CI）和Chou and Talalay 方法。使用相互排他性假設(shè)計(jì)算CI值（藥物作用機(jī)理的不同，）軟件，可上線的網(wǎng)站：，和繪制功能的FA（由這兩種藥物的組合影響系統(tǒng)分?jǐn)?shù)）。CI值 1表明兩種藥物之間的協(xié)同作用。. 統(tǒng)計(jì)分析同一個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行兩尾t檢驗(yàn)分析至少有三種生物學(xué)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的結(jié)果。. MVDN30耐藥細(xì)胞株的建立EBC1 肺癌細(xì)胞是MET沉癮細(xì)胞，它能放大MET的擴(kuò)增、過度表達(dá)和活化過程。MET TKIs或者M(jìn)VDN30對(duì)EBC1細(xì)胞里的MET具有強(qiáng)烈的破壞它們生存和上長(zhǎng)的能力的作用（圖A~C）。我們先前培養(yǎng)的EBC1細(xì)胞 對(duì)不同的YKIs有抗性表明了這種抗性可能是由于MET基因的進(jìn)一步擴(kuò)增。為了產(chǎn)生抗MVDN30的細(xì)胞，我們采用逐步暴露EBC1原代細(xì)胞不方法來增加抗體的濃度，并且獲得抗不同劑量抗體的細(xì)胞系（圖1b；約的分步方法詳見材料和方法部分）。, 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們使用耐20細(xì)胞（ebc1 R20）和80（ebc1 R80）毫克/毫升mvdn30，劑量是分別是前面的約10倍和40倍，然后測(cè)這些細(xì)胞的抗體IC50（圖1a）。在有MVDN30存在的抗性細(xì)胞的生長(zhǎng)速度一直和WT細(xì)胞差不多（圖1C）。正如前面提到的，MVDN30發(fā)揮它的抑制活性是通過誘導(dǎo)MET的結(jié)構(gòu)域蛋白反正溶蛋白裂解，隨后又通過蛋白酶體受體介導(dǎo)受體降解。這種反應(yīng)減少了細(xì)胞表面的MET的大量表達(dá)，抑制了MET的活性和受體介導(dǎo)的生物學(xué)活性。如圖1D所示，事實(shí)上，MVDN30的治療導(dǎo)致了再EBC1細(xì)胞中的MET通過酪氨酸酶的磷酸化消除大量減少。與抗性細(xì)胞的生化分析相反的是顯示了在相同劑量抗體存在的情況下，MET也會(huì)磷酸化并且在質(zhì)膜上的大量的MET蛋白明顯高于保存在相同條件下的WT細(xì)胞（圖1D,E）。除此，盡管激活的下游目標(biāo)AKT和MAPK激酶都被保存在有抗體存在的條件下（圖1D）。所有的數(shù)據(jù)表明，抗EBC1細(xì)胞的MVDN30并不是通過一種足以消除它的結(jié)構(gòu)的活性的方法來下調(diào)MET，而是一種允許它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)它的結(jié)構(gòu)磷酸化的方法. 如圖1D,E所示，用MVDN30處理抗性細(xì)胞致使MET大量減少這種減少比處于同等條件下觀察的WT細(xì)胞中的減少更明顯。我們想知道在抗性細(xì)胞里的抗體受損是否是由于MET的結(jié)構(gòu)域IPT4發(fā)生突變引起，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是它的集合位點(diǎn)，但是我們沒有發(fā)現(xiàn)任何突變（數(shù)據(jù)顯示）。于是，我們?cè)u(píng)估了是否是抗性細(xì)胞中脫落的MET胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）對(duì)抗體的反應(yīng)被抑制了。在相同劑量MVDN30存在的條件下培養(yǎng)了24小時(shí)的抗性細(xì)胞和WT細(xì)胞的上清液中，抗性細(xì)胞上清液中含有更豐富的脫落的ECD（圖2A）。當(dāng)對(duì)去處抗體24小時(shí)后的抗性細(xì)胞中MET的表達(dá)和活化進(jìn)行評(píng)估時(shí)，我們觀察到MET總量強(qiáng)烈增加特別是結(jié)合在細(xì)胞膜上的形式（圖2B和圖1）。 對(duì)抗性細(xì)胞再引入MVDN30細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致上清液中MET ECD含量更高，與在同樣劑量處理的WT細(xì)胞相比，之后細(xì)胞內(nèi)的MET同時(shí)減少了并返回到平時(shí)觀察的抗性細(xì)胞的一半水平（圖2 D）。在脈沖代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中也觀察到了相似的結(jié)果：比起WT細(xì)胞，抗性細(xì)胞合成更多的MET和MVDN30來促進(jìn)MET ECD 釋放并大量增加（圖2E）。最后， 用更高劑量抗體20 mg/ml (R20)處理EBC1細(xì)胞來更好的證明MVDN30在抗性細(xì)胞中是具有活性的。圖2F所示在抗性細(xì)胞中隨著MVDN30劑量是增加減少了大量MET在細(xì)胞膜上的表達(dá)（圖2A）和磷酸化(圖2B)。總之，所有的結(jié)果表明EBC1細(xì)胞的抗性不是因?yàn)镸VDN30活性缺乏，而是由于用它的飽和能力來促進(jìn)了一種高效的MET解離。圖1 抗MVDN30的EBC1細(xì)胞分子表征。 (A) 在有MVDN30的遞增濃度的條件下培養(yǎng)了72小時(shí)的EBC1 WT細(xì)胞的細(xì)胞活力。對(duì)未經(jīng)過處理的細(xì)胞(100%) 177。 。 (B) 在指定濃度抗體的條件下培養(yǎng)72小時(shí)的EBC1 WT細(xì)胞或產(chǎn)生MVDN30抗性的細(xì)胞(R10, R20, R40, R80)。與未經(jīng)過處理的WT細(xì)胞(100%) 177。 。 (C)