【文章內(nèi)容簡介】 A替代中段，如IMBL系列載體。圖13　野生型λ噬菌體DNA及相應(yīng)的λ噬菌體DNA圖譜插入或置換中段外來的DNA長度是有一定限制的，當噬菌體DNA長度大于野生型λ噬菌體基因組105%或小于78%時，包裝而成的噬菌體存活力顯著下降。所以λ噬菌體載體可插入長520kb的外來DNA，這比質(zhì)粒載體能插入的DNA長得多；而且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌要比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫。但λ噬菌體載體的克隆操作要比質(zhì)粒載體復(fù)雜?！　∪绻麑⒆笥冶酆椭卸味既コ瑑H留下λDNA而端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標志基因、多克隆位點等，就可構(gòu)成cos質(zhì)?；蚍Q為粘粒的載體。粘?？刹迦?5kb長的外源DNA，然后用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質(zhì)粒的形式在細菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構(gòu)建?！〉谌?jié) 動物病毒載體　　質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細胞中表達或試驗其功能、或作基因治療等。　　人基因組十分龐大，約含4109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeast artificial chromosome,YAC）載體應(yīng)運而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點（centromere）及復(fù)制起點等功能序列，可插入長度達200500kb的外源DNA，導(dǎo)入酵母細胞可以隨細胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計劃的重要載體。（三）猴病毒40（SV40）　　猴病毒40（SV40）的基因組常用來作為克隆載體，把外源DNA轉(zhuǎn)入哺乳類細胞。猴病毒40是球形動物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個共價閉環(huán)的雙鏈DNA基因組，全長5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細胞都會出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側(cè)順序）整合在SV40中后，在被感染的猴腎細胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。表明猴腎細胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級轉(zhuǎn)錄本?！　】墒?，SV40作為克隆載體有其局限性：①SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性，不利于外源DNA的重組和表達；②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān)，使用時有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。（四）逆轉(zhuǎn)錄病毒　　逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個基因：gag編碼病毒的核心蛋白；pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因（onc），即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來，已設(shè)計構(gòu)建成一些缺陷型病毒（defective virus）使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細胞，并在細胞中表達。Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識別外殼蛋白進行包裝的信號（一段尚未鑒定的DNA順序）。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細胞株，這種細胞株包含有輔助病毒（helper virus）。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識別蛋白外殼進行包裝的信號，因此它不能包裝成病毒顆粒。當用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時把受感染的細胞同骨髓細胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA，進入骨髓細胞，病毒DNA插入宿主細胞基因組，基因的活性得到表達。這時，由于骨髓細胞里面沒有輔助病毒，所以整合進宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過細胞分裂而傳給下一代子細胞。第四節(jié) 其他載體　　現(xiàn)在提到的分子載體有的不是用于克隆某基因，而是作為外源基因進入受體細胞的運載工具?！　。ㄒ唬┺D(zhuǎn)座子載體　　這里主要提一下有關(guān)果蠅轉(zhuǎn)座因子（P因子）作為基因載體。因為這是很有希望的真核生物基因工程的載體，果蠅的P因子約長3kb，每端各有反向重復(fù)順序，當它插入基因組時，可以激活或滅活近旁的基因，當它從基因組上切下來時，也可能把近旁的基因或DNA順序一起切下而引起突變?，F(xiàn)在已能把帶有某種限制酶切點的P因子克隆到質(zhì)粒pBR322中，然后在P因子酶切點上插入外源DNA。經(jīng)過擴增后，將這種重組DNA用微量注射儀直接注入果蠅的受精卵中。結(jié)果所克隆的基因能隨P因子插入受體細胞的基因里，并且得到表達?！　。ǘ┤斯の⑿∪旧w　　包括人體在內(nèi)的高等生物基因工程中遇到的一個難題是缺乏合適的基因載體。要求載體對受體細胞沒有危害，能安全、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)給后代，使基因的性狀得到連續(xù)的表達。這對校正某種遺傳缺陷或改進某種性狀都是十分有用的。目前一些實驗室正致力于構(gòu)建人工微小染色體（microchromosome）。　　構(gòu)建染色體應(yīng)包括：基因、復(fù)制起點、著絲粒和端粒。染色體上需帶有基因是不言而喻的。復(fù)制起點是染色體復(fù)制所不可缺少的。著絲粒保證復(fù)制后的染色體均等地分配到兩個子細胞中。端粒具有某種特定結(jié)構(gòu)以保證染色體的個體性。　　首先，構(gòu)建的是酵母的人工微小染色體。天然的酵母染色體為1501000kb。人工構(gòu)建的微小染色體長55kb，在細胞內(nèi)很穩(wěn)定，只是每個細胞里的拷貝數(shù)很少。比如已構(gòu)成的人工微小染色體為715kb，每個細胞里的拷貝數(shù)雖然增多，但不夠穩(wěn)定?！　∪斯?gòu)建酵母微小染色體的具體步驟見圖14。從圖中可以看到，先用質(zhì)粒pBR322為材料，連接酵母的標記基因Leu2（亮氨酸）后去轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后再接上酵母染色體上分離得到的著絲粒CEN3，再去轉(zhuǎn)化大腸桿菌以增殖重組質(zhì)粒，取得下一步實驗用的DNA。接下去是連接從酵母（真核生物）中分離得到的ARS1。ARS是指自主復(fù)制順序（autonomously replicating sequence），這個順序中可能包含著復(fù)制起點。目前已從非洲爪蟾的線粒DNA，衣藻和煙草葉綠體和核DNA中分離ARS。最后一個步驟是接上染色體端粒。用的是四膜蟲（tetrahymena）的rDNA末端（Tr末端）。這樣構(gòu)建成的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化酵母細胞后，在細胞內(nèi)斷開成為線狀重組DNA分子，可以象天然染色體一樣地復(fù)制和分離，這就是酵母線狀質(zhì)粒YLp4。圖14　構(gòu)建酵母人工微小染色體的步驟載體（vector）是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細胞，使之傳代、擴增、表達的工具。載體有質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質(zhì)粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復(fù)制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標記；有供外源DNA插入的位點；本身體積小等特征。　　質(zhì)粒存在于多種細菌，是染色體（核）以外的獨立遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質(zhì)結(jié)合。質(zhì)粒有嚴緊型和松弛型之分。嚴緊型由DNA多聚酶Ⅲ復(fù)制，一個細胞可復(fù)制15個質(zhì)粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復(fù)制，一個細胞可復(fù)制3050個質(zhì)粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制更多的質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)過改造品種繁多，常用的有pBR32pUC系列等。這些質(zhì)粒都含有多個基本基因，如復(fù)制起動區(qū)（復(fù)制原點Ori），便于復(fù)制擴增；抗抗生素標記（抗氨芐青霉素Apr、抗四環(huán)素Tcr等）或大腸埃希氏菌部分乳糖操縱子（ LacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發(fā)動子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉(zhuǎn)錄終止序列，便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的切點，即基因插入位點，又叫基因重組位點，基因克隆位點?！　〕Ｓ檬删w載體有單鏈噬菌體M13系統(tǒng)；雙鏈噬菌體系統(tǒng)。噬菌體應(yīng)和相應(yīng)的宿主細胞配合使用。第二章 工具酶工具酶是基因重組技術(shù)不可缺少的工具。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等。限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶之分，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，并在識別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉(zhuǎn)對稱。切口分平端和粘端，產(chǎn)生3′OH和5′P末端（見表21）。限制性內(nèi)切酶品種多，使用時應(yīng)注意溫度、緩沖液用量（一般1μg DNA/25單位酶）等反應(yīng)條件。表21 Alu Ⅰ和Eco RⅠ識別順序和切割位點酶識別序列切口Alu Ⅰ…AGCT……AG CT…四核苷酸…TCGA……TC GA…平端切口Eco RⅠ…GAATTC……G AATTC…六核苷酸…CTTAAG……CTTAA G…粘端切口　　連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希氏菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平末端，也可連接粘性末端。反應(yīng)需有Mg2+和ATP存在。最適溫度為37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNA的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，一般平末端連接用2025℃，粘端連接用16℃左右?！　【酆厦赣蠨NA聚合酶（以DNA為模板合成DNA的大腸埃希氏菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希氏菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外，發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性）?！　〈竽c埃希氏菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′ 及3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌蛋白酶作用后產(chǎn)生的一個大片段，有5′→3′ 聚合酶和5′→3′ 外切酶活性，無3′→5′ 外切酶活性?？捎糜谌笨诜g法（nick translation）標記核酸，也可用于DNA序列測定，修補DNA鏈等?！　『怂崦赣蠨Nase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應(yīng)的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用于切去dscDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)?！　∧┒宿D(zhuǎn)移酶在Mg2+存在下，選擇3′OH端單鏈DNA為引物加入核苷酸，在Co2+存在下，選擇3′OH端雙鏈DNA為引物加入核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端標記和核酸連接的互補多聚尾?！　A性磷酸酶去除5′P，可防止兩分子DNA片段5′ 端P基團自身空間障礙，影響DNA分子之間的連接，一般用堿性磷酸酶處理載體DNA除去5′ 端磷酸基團，在連接酶作用下目的基因的5′ 端P先與載體3′ 端OH連接，再通過復(fù)制修復(fù)另一條鏈，使兩條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率（圖21）。圖21　經(jīng)堿性磷酸酶處理后載體DNA與目的基因DNA的連接第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)當λ(k) B時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。 B的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。最早分離出的限制內(nèi)切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK，是I型的，沒有實用價值。首個II型限制內(nèi)切酶是在1970年， influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的體外精確切割成為可能。從此，相關(guān)研究展開。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出3000種限制性內(nèi)切酶中，其中有30%是在NEB發(fā)現(xiàn)的。限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease ）是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開的是3′，5′磷酸二酯鍵。二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類 分為I型、II型和III型。三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體，字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco ，流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為Hin；用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則用羅馬數(shù)字標出，比如Eco R I、Hind III。四、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別位點的特異性 每種酶都有其特定的DNA識別位點，通常是由48個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。識別序列的對稱性 靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。切割位點的規(guī)范性 交錯切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念粘性末端（cohesive ends）：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。平 末 端 ：Blunt end在識別序列對稱處同時切開DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。同裂酶（isoschizomers）：能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內(nèi)切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。同尾酶（isocaudamers）：識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如BamH I 、Bcl I、Bgl II和Xho I 是一組同尾酶。由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一個限制酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，