【文章內(nèi)容簡介】 置30min。 (2) 42℃水浴90s，不要擺動試管。 (3) 快速將試管轉(zhuǎn)移至冰上，冷卻2min。 (4) 每管加入200uL LB，37℃振蕩45min—1hr。 (5) 涂板(Kan)。 (6) 至液體完全吸收后，倒置平板，37℃培養(yǎng)。 提質(zhì)粒 用小量堿法提取質(zhì)粒：(1) ，于4℃，12000rpm離心30”。(2)吸去上清，空氣干燥沉淀。沉淀懸浮于100ul溶液Ⅰ中（25mM TrisHCl , 10mM EDTA, 50mM葡萄糖）中，振蕩混勻室溫放置5分鐘。(3)假如200ul溶液Ⅱ（ NaOH, 1%SDS），放冰浴中5分鐘。(4)再加入150ul溶液Ⅲ（3M NaAc, ），放冰浴中510分鐘，12000rpm 4℃離心5分鐘。取上清加等量酚：氯仿，振蕩，4℃，12000rpm 2分鐘。(5)取上清加2倍體積乙醇，振蕩，置2分鐘。(6)4℃，12000rpm 2分鐘，吸去上清，瀝干。(7)加1mL 70%乙醇洗滌2次。(8)用50ul TE溶解（加入1ul Rnase）。 酶切鑒定及PCR鑒定 。 GUS活性的組織化學(xué)定位部分 組織培養(yǎng)(1)將植物長出兩周的主根切下成510mm的小段，轉(zhuǎn)移至CIM中誘導(dǎo)其長愈傷。(2)三周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至SIM中誘導(dǎo)其長芽。(3)設(shè)未轉(zhuǎn)基因植物作負(fù)對照，對照和處理之間的培養(yǎng)條件要完全一致。(4)不論在CIM中還是在SIM中，培養(yǎng)基要每12周續(xù)代一次，及時更新。(5)注意大量培養(yǎng)，在由CIM轉(zhuǎn)移至SIM的同時，應(yīng)保留一部分材料作CIM續(xù)代，以此作為SIM培養(yǎng)下的處理的另一種對照。(6)實(shí)驗(yàn)過程中特別要注意無菌操作！ GUS活性檢測(1)當(dāng)植物的根在CIM中培養(yǎng)時，每隔23天作一次GUS組織化學(xué)染色進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。(2)當(dāng)愈傷組織在SIM中培養(yǎng)時，每隔一周左右作一次檢測。等到長出再生芽和再生根時，切下芽和根分別作檢測。(3)未轉(zhuǎn)基因的對照必須和處理始終同步進(jìn)行。(4)設(shè)置重復(fù)，至少35次。(5)具體方法：a. 無菌操作，將要檢測的植物部位小心切下來，轉(zhuǎn)入GUS染液，使材料和染液的體積比1:5。b. 真空處理210分鐘。c. 放入37℃恒溫箱中溫育1216小時。d. 待GUS滲入材料中后，材料轉(zhuǎn)入透明液中透明，放置于室溫下3小時。 經(jīng)透明處理后的植物材料在Motic 解剖鏡下觀察，有GUS表達(dá)的部位顯 現(xiàn)穩(wěn)定、不溶于透明液的藍(lán)色。解剖鏡上接理光XRX 2000相機(jī)照相， 相片通過Acer ScanPrisa 640U型掃描儀輸入電腦，由Adobe Photoshop 作適當(dāng)處理。 整體原位雜交 探針標(biāo)記 限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒LFY：antisense BamH1Sense KpnI(1)37C 消化2小時，電泳檢查線性化是否完全；(2)加等體積酚氯仿，混勻；(3)12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，收集上清，(4)加2倍體積無水乙醇（預(yù)冷），混勻，20C，30分鐘；(5)12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，(6)加70%乙醇（預(yù)冷），棄上清，(7)真空干燥，沉淀溶于10微升無菌水中；(8)電泳檢測。體外轉(zhuǎn)錄(1)每個反應(yīng)體系內(nèi)含：模板4微升，5*緩沖液4微升，DTT2微升，RNA Block 1uL，5*NTP 4微升，Polymerase 2微升，DEPCH2O 3微升。37C 2小時。LFY： antisense T3Sense T7(2)Dnase I 于37C處理15分鐘以除去模板，每個體系加 NaAc和75微升的預(yù)冷的無水乙醇，20C 過夜，(3)4C 下離心15分鐘，13000轉(zhuǎn)；(4)70%預(yù)冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升DEPCtreated H2O。堿性水解(1)50微升探針加50微升碳酸緩沖液，60C 水解，LFY45分鐘， 每管加10微升5%乙酸，置冰上；(2)每管加11微升的3MnaAc，200微升預(yù)冷無水乙醇，20C 過夜；(3)4C 下離心15分鐘，12000轉(zhuǎn)；(4)70%預(yù)冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升甲酰胺。 原位雜交(1)固定FB 30min甲醇 2次 5min乙醇 4次 5min(2)雜交預(yù)處理乙醇 2次 2min1:1 乙醇:二甲苯 30min乙醇 2次 5min甲醇 2次 5min1:1 甲醇:PBT 10minPBT+5%甲醛 30minPBT 3次 2minPBT+40ug/mL 蛋白酶K 1015minPBT+% 甘氨酸 5minPBT 2次 2minPBT+5% 甲醛 30minPBT 4次 2min1:1 PBT:HS 10minHS 2次 2min預(yù)雜交 2hr 60℃(3)雜交400uL HS + 3uL RNA probe + salmon tests DNA (100ug/mL)（探針和salmon tests DNA預(yù)先85℃變性5min）1620hr 60℃(4)雜交后處理HS 2次 30min 55℃1:1 HS:NTE 60minNTE 60minNTE 2minNTE+40ug/mL Rnase A 45min 37℃NTE 15min 37℃NTE 5次 15min1:1 NTE:PBT 20minPBT 2minBS 至少30min(5)檢測antiDIG抗體處理a. 等量混合固定后的和新鮮材料+少量冰冷90%丙酮，液氮中磨成細(xì)粉b. 加入更多90%丙酮，使勁混合均勻