guan6外源基因在真核細胞中的表達(編輯修改稿)
2025-06-15 15:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 肽，那么釀酒酵母轉(zhuǎn)換酶或 a配對因子 (MFa1)的前導序列可以非常有效地引導體積稍小的產(chǎn)物出胞。一般情況下，應(yīng)用酵母特有的分泌信號表達外源基因獲得成功的可能性大。 ? 但酵母表達基因工程產(chǎn)物的另一問題是信號肽加工不完全，其表達的外源基因產(chǎn)物常比設(shè)計的多幾個氨基酸。這可能是酵母細胞自身調(diào)節(jié)機制對外源基因高表達的應(yīng)答表現(xiàn)。 ? Singh等通過定向缺失誘變 MFa1和干擾素基因連接處寡核甘酸導致了含有天然 N端的成熟干擾素的正確釋放，可以成為解決這一問題的一種好方法。 ? ? 酵母細胞膜上有一種 KEX2樣蛋白水解酶，能專一性水解 a因子前體中羧基端的肽鍵，即連續(xù)兩個堿性氨基酸(如 LySArg， LysLys， ArgArg)， 酵母基因工程表達產(chǎn)物發(fā)生降解現(xiàn)象的原因就在于此。 ? 改變培養(yǎng)基的 PH值、加入適量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物，都能夠提高外源蛋白的穩(wěn)定性，而某些酶抑制劑如 EDTA， 雖然也能增加其穩(wěn)定性，但卻常會使一些原先并不明顯的蛋白變得非常明顯，影響其使用效果。 ? 另外，使用蛋白酶缺陷株如 SMD116 SMD1165或SMD1168亦可避免產(chǎn)物降解的發(fā)生。雖然并不是每一種外源蛋白都會受內(nèi)源性蛋白酶的影響，但在未知其有無降解可能的情況下可以考慮使用此種宿主菌。 在另外一種情況下，如果基因工程產(chǎn)物會影響宿主菌生長代謝活性的話，也可能出現(xiàn)高度降解的情況。如重組人基質(zhì)金屬蛋白酶 3(MMP3)被認為有促使哺乳動物上皮細胞凋亡的作用。它在 Pp中高度降解，僅當與其組織抑制物 TIMP1共表達時才能保持穩(wěn)定。這也提醒我們外源基因本身對產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響同樣重要。 ? 一般情況下 Pp能產(chǎn)生較釀酒酵母明顯要短的高甘露糖型寡糖鏈，且較均一，長度在 8－ 14個之間，使產(chǎn)物更加穩(wěn)定，而這正是 Pp表達外源蛋白的一個優(yōu)勢。 雖然糖基化對某些外源蛋白的活性沒有太大影響，它卻可能在蛋白折疊和抗蛋白酶降解中起重要作用。然而，糖基化也有其不利的一面。例如人紅細胞生成素受體的胞外配體結(jié)合區(qū) (EPObp)因糖基化程度不同而呈兩種狀態(tài) (30X103和 60X103)。人組織因子則在 SDSPAGE上以從 37X103到 45X103的 3個條帶存在。 另外，聚合體的存在也會成為產(chǎn)物不均一的原因，這些都給基因工程產(chǎn)物的純化和工業(yè)化生產(chǎn)帶來一定困難。 ? 從藥物應(yīng)用的觀點來看，不合適的糖基化和寡聚體可能會在機體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)或毒副作用，并且會明顯影響純化過程中產(chǎn)率的提高，因此，選用一種能夠獲得單體均一形式的基因工程產(chǎn)物十分重要。這方面的研究仍有待探索。 ? 作為一種正在發(fā)展中的表達異源蛋白的宿主體， Pp酵母菌兼有原核細胞的分子遺傳操作和生長特性及真核生物的翻譯后修飾機制的長處。 ? 雖然目前存在的諸多困難使得仍有許多蛋白難以在這個系統(tǒng)中成功表達，但隨著對它的利用和探索的不斷深入必將不斷給我們增添新的見解，
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