【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 度高時(shí)，分子末端數(shù)也高，連接幾率增加，反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量隨之上升； DNA 分子濃度也影響反應(yīng)體系中的產(chǎn)物構(gòu)型。通常在兩種構(gòu)型產(chǎn)生：①線性 DNA 分子，不同 DNA 分子之間首尾相連形成線狀結(jié)構(gòu)；②環(huán)狀 DNA 連接物，同一分子的兩個(gè)末端或多個(gè)分子首尾連接形成的線性分子的兩端 發(fā)生連接反應(yīng)，形成環(huán)化分子。重組 DNA 分子的構(gòu)型對(duì)后續(xù)的轉(zhuǎn)化過(guò)程有顯著的影響，例如用λ噬菌體載體構(gòu)建的重組子在線性結(jié)構(gòu)時(shí)，更適用于包裝成成熟的病毒顆粒而有效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而質(zhì)粒載體則應(yīng)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)才有利于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。 二、重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞 帶有外源 DNA 片段的重組體分子在體外構(gòu)成之后，需要導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞進(jìn)行繁殖，才能夠獲得大量的純一的重組體 DNA 分子。這樣一種過(guò)程習(xí)慣上叫做基因的擴(kuò)增（ amplification）。由此可知，選定的寄主細(xì)胞必須具備使外源DNA 進(jìn)行復(fù)制的能力，而且還應(yīng)該能夠表達(dá)導(dǎo)入的重組體分 子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的原則與鑒定。 將外源重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑，包括轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適應(yīng)于細(xì)菌一類的原核細(xì)胞和酵母這樣的低等真核細(xì)胞，而顯微注射和電穿孔則主要應(yīng)用于高等動(dòng)植物的真核細(xì)胞 三、陽(yáng)性重組子的篩選和鑒定 在 DNA 重組完成并轉(zhuǎn)化了相應(yīng)的宿主細(xì)胞以后，必須對(duì)其進(jìn)行篩選和鑒定。這是由于選用的載體、宿主細(xì)胞的差異所決定的，同時(shí)在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，常出現(xiàn)多種結(jié)果，例如非重組子轉(zhuǎn)化、野生載體轉(zhuǎn)化、外源基因多拷貝轉(zhuǎn)化等結(jié)果。這些均與 陽(yáng)性重組子的轉(zhuǎn)化不易區(qū)分，因此需要根據(jù)不同的載體、宿主及外源 DNA的性質(zhì)，選用不同的篩選和鑒定方法。 四、克隆基因的表達(dá) 基因表達(dá)是基因工程中的主要內(nèi)容，包括目的基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工等內(nèi)容。因此將某一目的基因克隆后，再將其導(dǎo)入到適宜的表達(dá)系統(tǒng)中，才能獲得相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物。而基因表達(dá)系統(tǒng)包括載體和相應(yīng)的宿主細(xì)胞兩部分。目前，基因工程中將載體分為克隆載體和表達(dá)載體。在克隆載體中通常僅帶有一個(gè)松弛型復(fù)制子、一個(gè)多克隆位點(diǎn)和一個(gè)篩選標(biāo)記，以便被克隆和篩選的DNA 序列能夠大量增殖。而表達(dá)載體除了上述因子 外，還需要有強(qiáng)啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、翻譯起始密碼子和終止密碼子等一系列調(diào)控序列。在基因工程中除了選擇合適的載體以外，還要選用相應(yīng)的宿主細(xì)胞，一起組成表達(dá)系統(tǒng)。常用的表達(dá)系統(tǒng)主要有原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)主要有：大腸桿菌系統(tǒng)和枯草桿菌系統(tǒng)等。真核表達(dá)系統(tǒng)主要有：酵母細(xì)胞系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞 (桿狀病毒 )系統(tǒng)和高等植物系統(tǒng)等。下面主要介紹利用大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)外源基因的原核系統(tǒng)和在酵母菌中表達(dá)外源基因的真核系統(tǒng)。 大腸桿菌作為表達(dá)宿主 1977 年，研究者第一次成 功地在大腸桿菌中表達(dá)了人類生長(zhǎng)激素釋放抑制因子，此后，大量的真核生物基因在此系統(tǒng)中得到表達(dá)。這些細(xì)菌沒有真核生物所具有的翻譯后的修飾作用，因此該系統(tǒng)特別適用于沒有修飾或只有有限修飾的蛋白質(zhì)的合成。該表達(dá)系統(tǒng)處理容易，使用安全，雖不能將蛋白質(zhì)加工成熟完全，但也成為這些蛋白質(zhì)的重要表達(dá)宿主。許多基因重組蛋白產(chǎn)物都已在大腸桿菌中成功表達(dá)，如生長(zhǎng)激素、胰島素、干擾素和白介素 2，這些蛋白在體內(nèi)都是分泌型的蛋白質(zhì)，因此在分泌過(guò)程中可發(fā)生有限的翻譯后修飾，如肽鍵的斷裂、二硫鍵的形成等。在以大腸桿菌表達(dá)時(shí)，為獲得正確形式的 蛋白質(zhì)，許多有創(chuàng)意的方法被設(shè)計(jì)出來(lái)，必要時(shí)還可在體外進(jìn)行最后的修飾。 為得到高水平表達(dá)，人們致力于研究在表達(dá)載體中插入適當(dāng)片段的方法。有人采用高轉(zhuǎn)錄效率的細(xì)菌基因啟動(dòng)子，通過(guò)組合型啟動(dòng)子或改變生長(zhǎng)環(huán)境 (溫度、化學(xué)物質(zhì)等 )的方法可使調(diào)控型啟動(dòng)子開啟或關(guān)閉。例如來(lái)自于乳糖操縱子 噬菌體啟動(dòng)子 PR 的 lac 啟動(dòng)子，其優(yōu)點(diǎn)是：只有當(dāng)相對(duì)密度達(dá)到一定的水平時(shí)，重組蛋白質(zhì)的合成才開始，且在很短的蛋白質(zhì)合成期間就能產(chǎn)生足夠所需量的蛋白。 酵母菌作為表達(dá)宿主 酵母菌是主要以單細(xì)胞生存的真菌，作為真核生物酵母 菌能在人體內(nèi)進(jìn)行翻譯后修飾，這點(diǎn)對(duì)中等復(fù)雜度的蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn)是很有用的，但非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)要在更高級(jí)的有機(jī)體內(nèi)表達(dá)。食品生產(chǎn)中一直采用酵母為工具，這為將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)提供了方便。許多生物學(xué)家認(rèn)為，現(xiàn)在使用的釀酒用酵母 (面包酵母 )是一個(gè)較好的表達(dá)系統(tǒng)，并已經(jīng)在基因水平和分子水平上進(jìn)行了廣泛的研究。將來(lái)，其他的酵母類型如 Pichia pastoris、 Hansenula Polymorph 和Yarrowia lipolytica 也許都會(huì)用于藥物生產(chǎn)。迄今為止，只有 (啤酒酵母 )生產(chǎn)出的藥物已用于人體，如胰島素和乙型肝炎疫苗。 像大腸桿菌一樣， 也含有自然質(zhì)粒 (2μ m 質(zhì)粒 )，連上選擇性標(biāo)記后可作為載體。含有突變的酵母基因經(jīng)常用于質(zhì)粒的選擇，而不采用抗性基因標(biāo)記，這一方法也可用于大規(guī)?？股氐暮Y選。 作為真核生物，酵母細(xì)胞有分泌通道，這一通道很像哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌過(guò)程，它經(jīng)常用于分泌型重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，原因有兩點(diǎn)：①分泌型蛋白翻譯后的修飾在分泌過(guò)程中進(jìn)行；②易于純化。但是在分泌過(guò)程中常常會(huì)出現(xiàn)一些不太令人滿意的情況，例如 N連接、 O— 連接、糖基化修飾的 缺失、糖基化側(cè)鏈的形成等在酵母與人細(xì)胞中不同。酵母產(chǎn)生的糖蛋白對(duì)人有免疫源性，因而糖蛋白不適合在酵母中生產(chǎn)。 五、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 一種克隆的外源基因，是否能夠在新宿主細(xì)胞中有效地表達(dá)，需要通過(guò)一定的實(shí)驗(yàn)才能作出正確的判斷。如果我們事先已經(jīng)知道克隆基因編碼的蛋白質(zhì)或RNA 組成，就能夠據(jù)此設(shè)計(jì)出適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)，檢測(cè)基因在新宿主中的表達(dá)情況。例如，化學(xué)合成的激素和胰島素基因，可用敏感的放射免疫測(cè)定法檢測(cè)； 5S RNA可用適當(dāng)?shù)奶结樳M(jìn)行雜交檢測(cè)，對(duì)于某些酶產(chǎn)物，可以通過(guò)同適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)缺陷突變型宿主間的互補(bǔ)作用予以檢測(cè) 。目前，檢測(cè)基因表達(dá)的方法以及分析被檢測(cè)基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的情況有下列方法； Northern 雜交 檢測(cè)細(xì)胞中是否含有特定的 mRNA，測(cè)定特定 mRNA 在總 RNA 中的比例，由此獲得目的 mRNA 的轉(zhuǎn)錄情況。 斑點(diǎn)雜交 用特異性探針檢查 mRNA，并估計(jì)表達(dá)過(guò)程中 mRNA 的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 分析誘導(dǎo)前后細(xì)胞中目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。如表達(dá)水平很低，可用同位素作為放射性標(biāo)記，如 35 S甲硫氨酸或 35S半胱氨酸進(jìn)行代謝標(biāo)記，然后進(jìn)行 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影，或在 We stern 雜交中用特異性單克隆抗體或多克隆抗體分析目的蛋白質(zhì)存在與否及其含量。 免疫學(xué)方法 利用特異性抗體與目的蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)免疫沉淀、 ELISA 等免疫學(xué)方法，檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。例如，免疫沉淀法可用于檢測(cè)并定量分析多種蛋白質(zhì)混合物中的靶抗原。這種方法很敏感，可檢測(cè)出 100pg 的放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)。當(dāng)與 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳并用時(shí)，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)情況。放射性標(biāo)記靶蛋白的免疫沉淀以及其后的分析包括下列幾個(gè)步驟：①靶蛋白的放射性標(biāo)記；②裂解細(xì)胞，③特異性免疫復(fù)合物的形成； ④免疫復(fù)合物的收集及純化；⑤放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的免疫沉淀分析。 第三節(jié) 基因工程技術(shù)在藥物研究中的應(yīng)用 一、細(xì)胞膜受體作為藥物研究的靶點(diǎn) 藥物的基本作用部位是酶、受體、離子通道和活性轉(zhuǎn)移復(fù)合物，這些作用部位都是蛋白質(zhì)，它們能通過(guò)克隆或相關(guān)基因表達(dá)的方法而得到，這一點(diǎn)對(duì)于非肽類藥物的研究和發(fā)展有深遠(yuǎn)的影