【文章內(nèi)容簡介】 作用，使用時(shí)應(yīng)慎重。 為了使用方便，無論是大量元素還是微量元素都常常是先配制成母液（即比實(shí)際培養(yǎng)基中的使用濃度高的儲(chǔ)存液），儲(chǔ)存在4度冰箱內(nèi)或在室溫下短期存放。 總之，植物必需營養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。此外，在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面起著重要作用。當(dāng)某些營養(yǎng)元素供應(yīng)不足時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；卻錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長。 碳水化合物 所有的植物組織培養(yǎng)基都需要有碳水化合物作為能源，但當(dāng)培養(yǎng)物通過光合作用提供的CO2能足以維持生長時(shí)可不在培養(yǎng)基上加碳源，這種情況是很少見的。用作碳源的碳水化合物通常為蔗糖或D葡萄糖，用量通常為2%4%，高者可達(dá)5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般應(yīng)增加用量，而且最好用比較固定的廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。在改用一批新的市售白糖時(shí)最好先做預(yù)試，以防在大量使用時(shí)出現(xiàn)問題，傷害培養(yǎng)材料，造成不必要的損失，因?yàn)槭惺郯滋鞘且环N混合物，成分復(fù)雜且不穩(wěn)定。幾乎所有的培養(yǎng)物在蔗糖作為碳源時(shí)生長都比較好，只有少數(shù)植物或組織在葡萄糖或果糖作為碳源的培養(yǎng)基上生長更合適。也有用麥芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作為碳源的。蔗糖在經(jīng)高溫滅菌后，會(huì)發(fā)生部分降解，產(chǎn)生D葡萄糖和D果糖等，與用過濾法滅菌相比，可能會(huì)出現(xiàn)一些不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但這并不說明高溫滅菌與過濾滅菌哪一種方式更好。如果要進(jìn)行比較嚴(yán)格、精確的實(shí)驗(yàn)，最好用過濾法滅菌蔗糖，除此之外在大部分情況下可與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高溫滅菌。研究表明蔗糖不僅作為碳源影響到培養(yǎng)物的營養(yǎng)狀況，而且在某些情況下還會(huì)影響到細(xì)胞的分化，如在進(jìn)行葉用萵苣的髓細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)木質(zhì)部分化的適宜濃度為2g/L，但要讓木質(zhì)部進(jìn)一步發(fā)育則最好再提高蔗糖濃度，這樣才能更有利于木質(zhì)部的形成。木質(zhì)部成分的分化，特別是管胞分子的分化形成，往往是器官發(fā)生的先決條件。 蔗糖、葡萄糖、白糖等的純度問題，現(xiàn)在也引起人們的注意，因?yàn)樵诮Y(jié)晶時(shí)，它們往往包藏有恒量的有機(jī)物如氨基酸等，這些雖然不會(huì)使實(shí)驗(yàn)受到很大影響，但有時(shí)可能影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，在使用時(shí)應(yīng)稍加留神。 糖的種類和用量是植物組織培養(yǎng)能否成功的重要因素之一。蔗糖的作用具有普遍性和廣泛性，這一點(diǎn)已無人懷疑。近年來，其它糖類在植物組織培養(yǎng)中的作用引起很大關(guān)注。在淀粉作為凝固劑的培養(yǎng)基中加入12%蜜二糖，比只加8%蔗糖的大麥花粉培養(yǎng)基產(chǎn)生胚狀體的頻率高35倍，可高達(dá)40%。乳糖、麥芽糖、半乳糖和甘油均可顯著促進(jìn)培養(yǎng)的柑橘的胚狀體發(fā)生。麥芽糖、麥芽浸出物和果糖對(duì)苜蓿胚狀體發(fā)生的促進(jìn)作用均大于蔗糖。葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖和蔗糖對(duì)培養(yǎng)的煙草原生質(zhì)體再生都有促進(jìn)作用，半乳糖則有抑制作用。麥芽糖可明顯提高培養(yǎng)的大麥花藥的綠苗產(chǎn)率，而蔗糖、果糖和葡萄糖單獨(dú)或麥芽糖混合使用，均不利胚狀體的生長。 植物生長調(diào)節(jié)劑 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是一些調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。植物生長物質(zhì)可分為兩類：一類是植物激素；另一類是植物生長調(diào)節(jié)劑。植物激素是指自然狀態(tài)下植物體內(nèi)合成，并從產(chǎn)生處運(yùn)送到別處，對(duì)生長發(fā)育產(chǎn)生顯著作用的微量（1微摩爾/升以下）有機(jī)物；植物生長調(diào)節(jié)劑是指一些具有植物激素活性的人工合成的物質(zhì)。但在平常工作中人們并沒有將它們嚴(yán)格區(qū)分開來，而籠統(tǒng)稱之為“激素”、“植物激素”或“植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)”。這類物質(zhì)既可以刺激植物生長，也可以抑制植物的生長，對(duì)植物的生命活動(dòng)真正起到調(diào)節(jié)作用。在植物組織培養(yǎng)中使用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有生長素類和細(xì)胞分裂素類兩大類，少數(shù)培養(yǎng)基中還添加赤霉素GA3等。生長素 生長素在植物體中的合成部位是葉原基、嫩葉和發(fā)育中的種子。成熟葉片和根尖也產(chǎn)生很微量的生長素。在植物組織培養(yǎng)中，生長素主要被用做誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分裂和根的分化。在植物組織培養(yǎng)中常用的生長素有：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），PCPA（對(duì)氯苯氧乙酸）、2，4D（2，4二氯苯氧乙酸），2，4，5T（2，4，5三氯苯氧乙酸）等。NAA有 α 和β兩種形式，是由人工合成的，培養(yǎng)基中總是用α型，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)總是說加α萘乙酸。與IBA相比，NAA誘發(fā)根的能力較弱，誘發(fā)的根少而粗，但對(duì)某些植物如楊樹等卻具有很好的效果，IBA在根的誘導(dǎo)與生長上作用強(qiáng)烈，作用時(shí)間長，誘發(fā)的根多而長，特別有效，但也不可一概而論。IBA是天然合成的生長素，可被光迅速溶解或被酶所氧化，由于培養(yǎng)基中可能有氧化酶存在，所以在使用濃度上應(yīng)相對(duì)較高（130mg/L）。對(duì)愈傷組織增殖最有效的是2，4D，特別是對(duì)單子葉植物，107105mol/L即可以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷，常常不需再加細(xì)胞分裂素。但2，4D是一種極有效的器官發(fā)生抑制劑，不能用于啟動(dòng)根和芽分化的培養(yǎng)基中。細(xì)胞分裂素 細(xì)胞分裂素是腺嘌呤（adnine,也叫6氨基嘌呤的衍生物。腺嘌呤的第6為氨基、第2位碳原子和第9位氮原子上的氫原子可以被不同的基團(tuán)所取代，當(dāng)被取代時(shí)就會(huì)形成各種不同的細(xì)胞分裂素，因此，確切的講應(yīng)該叫細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。植物和微生物中都含有細(xì)胞分裂素。細(xì)胞分裂素在植物生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均可表現(xiàn)出它的調(diào)節(jié)作用，由于它是一種腺嘌呤的衍生物，所以人們聯(lián)想到它的調(diào)節(jié)作用，由于它的調(diào)節(jié)作用可能對(duì)核酸的影響有關(guān)。它可以影響某些酶的活性，可以影響植物體內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸，可以調(diào)控細(xì)胞器的發(fā)生，還可以打破某些植物種子的休眠和延緩葉片的衰老?，F(xiàn)代生物學(xué)研究初步證明，細(xì)胞分裂素可以結(jié)合到高等植物的核糖核蛋白體上，促進(jìn)核糖體與mRNA的結(jié)合，加快翻譯速度，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成。它還可以與細(xì)胞膜和細(xì)胞核結(jié)合，影響細(xì)胞的分裂、生長與分化。在tRNA分子的反密碼子附近發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞分裂素的結(jié)合位點(diǎn)，這可能預(yù)示著細(xì)胞分裂素在基因表達(dá)的翻譯水平上具有調(diào)節(jié)作用，其實(shí)，細(xì)胞分裂素本身就是rRNA的組成部分，植物tRNA中的細(xì)胞分裂素就有異戊烯基腺苷、反式玉米素核苷、甲硫基異戊烯基腺苷和甲硫基玉米素核苷等數(shù)種。 自然情況下，細(xì)胞分裂素主要在根中合成，但根并不是唯一的合成部位，莖端、萌發(fā)中的種子、發(fā)育中的果實(shí)和種子也能合成。 在組織培養(yǎng)中使用細(xì)胞分裂素的主要目的是刺激細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的分化、葉片擴(kuò)大和莖長高，抑制根的生長。培養(yǎng)基中經(jīng)常使用的天然的細(xì)胞分裂素主要有：從甜玉米未成熟種子或其他植物中分離到的玉米素[6（4羥基3甲基反式2丁烯氨基）嘌呤]。人工合成的細(xì)胞分裂素主要有激動(dòng)素（KT，6呋喃氨基嘌呤）、6芐基腺嘌呤（6BA）、2IP（異戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。細(xì)胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長，細(xì)胞分化和器官形成。赤霉素 主要是GA3，雖然已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究，但在培養(yǎng)基中很少添加，因?yàn)樗淖饔猛秦?fù)面的。雖然也有赤霉素能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株的報(bào)道，但在使用中仍需慎重，不可輕易添加。如果想在實(shí)驗(yàn)中添加赤霉素，則必須先用一些不重要的材料做預(yù)試，待獲得肯定結(jié)果時(shí)再用于正式實(shí)驗(yàn)。乙烯 乙烯的作用逐漸引起重視，它在芽的誘導(dǎo)和管胞分化上具有一定作用，管胞分化往往又是器官發(fā)生的基礎(chǔ)。乙烯單獨(dú)地或與CO2共同加入瓶中以代替BA或BA+2，4D的作用，促進(jìn)水稻愈傷組織芽的生長，CO2對(duì)乙烯促芽的促進(jìn)作用明顯，AgNO3可逆轉(zhuǎn)乙烯和2，4D的抑制作用，促進(jìn)小麥愈傷組織生芽。在有IAA和KT時(shí)乙烯促進(jìn)Wigitalis obscura芽的形成。乙烯對(duì)芽形成的這種相對(duì)獨(dú)立的效果不只是因?yàn)榉N的差異，也與不同發(fā)育時(shí)期植物對(duì)乙烯的敏感性不同有關(guān)。如煙草的組織隨著培養(yǎng)時(shí)間而對(duì)乙烯的敏感性有變化，在培養(yǎng)早期促進(jìn)芽的發(fā)端，后期則起抑制作用。溫度可以影響乙烯的產(chǎn)生量，2535℃下產(chǎn)生量較高，可促進(jìn)水稻培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生根，15℃或40℃下產(chǎn)生量降低，不生根。番茄葉圓片培養(yǎng)時(shí)，乙烯抑制IAA誘導(dǎo)的生根。一般說來，依稀抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，非胚性愈傷組織比胚性愈傷組織產(chǎn)生更多的乙烯。在懸浮培養(yǎng)中，乙烯對(duì)細(xì)胞的指數(shù)生長期有雙向作用。由于乙烯是一種簡單的不飽和碳?xì)浠衔?，在生理環(huán)境的溫度和壓力下，是一種氣體，比空氣輕，實(shí)驗(yàn)中很難掌握用量，所以一般不使用。高等植物各器官都能產(chǎn)生乙烯，但不同組織、不同器官和不同發(fā)育時(shí)期，乙烯的釋放量不同。在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)的植物組織也會(huì)產(chǎn)生乙烯，如果封口用的是不透氣的塑料膜，容器內(nèi)就會(huì)逐漸積累乙烯，嚴(yán)重時(shí)可引起培養(yǎng)物的死亡。培養(yǎng)瓶內(nèi)乙烯的積累量因植物種類而不同，小麥的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物24H中每克干重可產(chǎn)生乙烯5nmol,水稻的為6nmol，亞麻的可高達(dá)900nmol。煙草的愈傷組織產(chǎn)生的乙烯量比胡蘿卜的高400倍。 瓊脂或其他支持物 除液體懸浮培養(yǎng)外，所有的培養(yǎng)物都應(yīng)生長在固定或半固定的培養(yǎng)基上以防止培養(yǎng)物沉入液體培養(yǎng)基，因缺氧而死亡。就目前情況而言，瓊脂是一種極為理想的支持物。它是由海藻得來的多糖類物質(zhì)，但并不是培養(yǎng)基中的必需成分，只是作為一種凝固膠黏劑使培養(yǎng)基變成固體或半固體狀態(tài)，以支撐培養(yǎng)物，雖然瓊脂只是作為一種膠連物，但由于其生產(chǎn)方式和廠家不同而可能含有數(shù)量和種類不等的雜質(zhì)，如Ca、Mg、Fe、硫酸鹽等，從而可能影響到培養(yǎng)效果或某些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在選擇瓊脂時(shí)，最好固定廠家，但國內(nèi)尚沒有一個(gè)比較穩(wěn)固的生產(chǎn)廠家提供優(yōu)質(zhì)瓊脂。雖然市售的瓊脂或瓊脂條價(jià)格便宜，可以使用，但其帶來的潛在副作用可能是組培失敗或中途夭折的主要原因。建議在經(jīng)濟(jì)條件允許的情況下，建議買進(jìn)口、固定廠家的商品。瓊脂的使用濃度取決于培養(yǎng)目的，使用的瓊脂性能（胨力張度、灰分、熱水中不溶物、粗蛋白等）等因素，%1%，質(zhì)量越差的瓊脂用量越大。除瓊脂外，為了更好的調(diào)控培養(yǎng)物的生長，現(xiàn)在發(fā)展的趨勢(shì)是使用一種含有瓊脂的混合物作為固體膠連劑，如Sigma公司生產(chǎn)的Agargel就是用瓊脂和Phytagl混合在一起的一種新型膠連劑，可以用來控制培養(yǎng)物的玻璃化。 培養(yǎng)基中添加瓊脂使培養(yǎng)基呈固體或半固體狀態(tài)，使培養(yǎng)物能夠處于表面，既能吸收必需的養(yǎng)分、水分，又可不致因缺氧而死亡。但固體或半固體狀態(tài)，一方面限制了培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分和水的移動(dòng)；另一方面也限制了培養(yǎng)的植物組織分泌物，特別是有毒代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散，使有培養(yǎng)物周圍的營養(yǎng)成分逐漸匱乏，代謝產(chǎn)物逐漸積累，植物生長受阻或受到毒害。為了解決這個(gè)問題，人們?cè)囼?yàn)使用其他支持物來代替瓊脂。濾紙橋法即是一種，該法是將一張較厚的濾紙折疊成M型，放入液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)的植物組織放在M的中間凹陷處，這樣培養(yǎng)物可通過濾紙的虹吸作用不斷吸收營養(yǎng)和水分，又可保持有足夠的氧氣。在此基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了一種類似與“看護(hù)”培養(yǎng)的方法，即在濾紙橋的中間凹陷處加一種固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基中也可混有分散的植物細(xì)胞團(tuán)，將材料放在固體培養(yǎng)基上，再把濾紙放入另一種液體培養(yǎng)基中，用兩種不同的培養(yǎng)基同時(shí)培養(yǎng)材料，可收到較好的效果。現(xiàn)在也有用玻璃纖維濾器或人工合成的聚酯羊毛代替瓊脂的試驗(yàn)中人們或許能受到一些啟發(fā)，即培養(yǎng)基中添加瓊脂的目的主要是為了支持培養(yǎng)物，只要達(dá)到這個(gè)目的，可選用不同的材料和方法進(jìn)行代替瓊脂的試驗(yàn)。需要考慮的主要問題是，這種材料必須無毒害作用，且不被培養(yǎng)的植物組織所吸收，不與培養(yǎng)液成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 瓊脂作為支持物或凝固劑對(duì)絕大部分植物都是有利的或者說是無害的，但也有一些報(bào)道說瓊脂對(duì)某些培養(yǎng)物不利。在馬鈴薯、胡蘿卜、煙草、小麥等作物組培中，均發(fā)現(xiàn)以淀粉代替瓊脂更有利于培養(yǎng)物的生長和分化。但是，目前情況下還沒有哪種支持物比瓊脂更優(yōu)越。 其他添加劑 為了特殊的培養(yǎng)目的，在一部分培養(yǎng)基中還添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，甲硫氨酸（蛋氨酸）， L酪氨酸、L天冬氨酸、L天冬酰胺、L谷氨酸、L谷氨酰胺、L精氨酸等氨基酸，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西紅柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁，活性炭，滲透調(diào)節(jié)劑等。添加少量甲硫氨酸有促進(jìn)乙烯合成和刺激木質(zhì)部發(fā)生的作用，但添加多種氨基酸后往往有制止生長的作用，這可能是由于各種氨基酸之間的相互競爭而引起的。對(duì)天然提取物的應(yīng)用雖然有不同觀點(diǎn)，有的主張使用，有的主張不使用，因?yàn)槠錉I養(yǎng)成分和作用無法弄明白，但在用已知化學(xué)物質(zhì)無法達(dá)到目的時(shí)，適當(dāng)使用一些天然混合物，的確使一些用常規(guī)培養(yǎng)方法沒有獲得愈傷或不能誘導(dǎo)再生的植物產(chǎn)生了愈傷和分化形成植株?；钚蕴? 活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉末結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松、孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力。粒度越小，吸附能力越大。溫度低吸附能力強(qiáng)，溫度高吸附能力弱，甚至解吸附。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5羥甲基糖醛及激素等。 莖尖初代培養(yǎng)，假如適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于VC和半胱氨酸；在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長，但其作用有一個(gè)閥值，%，%。 活性炭在生根時(shí)有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理一般認(rèn)為與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進(jìn)根生長的IAA，但I(xiàn)AA易受可見光的光氧化而破壞，因此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護(hù)了IAA，從而間接促進(jìn)了根的生長，由于根的生長加快，吸收能力增強(qiáng)，反過來又促進(jìn)了莖、葉的生長。 此外，%活性炭，還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對(duì)防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用。 活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，%的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產(chǎn)生較少的愈傷組織。 但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量的活性炭加入會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。很細(xì)的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。總之，那種隨意抓一撮活性炭放入培養(yǎng)基，會(huì)帶來不良的后果。因此，在使用時(shí)要有其量的意識(shí)，使活性炭發(fā)揮其積極作用。 也許是由于活性炭的存在使培養(yǎng)基變黑，產(chǎn)生了類似于