抗體制藥課件第三章(編輯修改稿)
2025-06-22 12:03 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 不純，骨髓瘤細胞不具有產(chǎn)生抗體的能力。 ? ②應(yīng)為 HGPRT缺陷的細胞系 其細胞內(nèi)嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成的補救途徑必須喪失。即磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或嘧啶核苷酸激酶的活力喪失，即 HGPRT陰性細胞。 ? ③融合率高，容易培養(yǎng)，所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定。 如： SP2/O和 。 ? （五）細胞融合 ? 基本方法： ? 取適量 B淋巴細胞（ 1 108/ml）與骨髓瘤細胞（ 2~3 107/ml）進行混合，在聚乙二醇（ PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時間在2min內(nèi)。 ? 然后用 HAT培養(yǎng)液將 PEG融合液緩慢稀釋。 ? 促進融合的條件 ? ①分子量在 400~6000，濃度在 10~60%之間的PEG溶液都能使細胞發(fā)生融合。 目前常用分子量 4000，濃度為 40~50%的 PEG溶液為最佳。 ? ②在 PEG溶液中加入二甲基亞砜（ DMSO），以提高細胞接觸的緊密性，提高融合率。 但 PEG和 DMSO都對細胞有毒性，必須嚴格控制它們與細胞接觸的時間，應(yīng)盡快用新配制的培養(yǎng)液來稀釋助融劑并洗滌細胞。 ? ③通過低速離心使細胞接觸更為緊密來提高融合率。 ? （六）選擇性培養(yǎng) ? 細胞融合后，可產(chǎn)生多種融合細胞， BB、B瘤、瘤 瘤的融合細胞，還有許多未融合的親株細胞，它們均比 B瘤融合的雜交瘤細胞有更強的增殖能力，很易將其淘汰。因此，融合后必須立即移入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 ? （ 1）選擇性培養(yǎng)的原理 ? 選擇性培養(yǎng)基為 HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌呤（ H）、氨基喋呤（ A）和胸腺嘧啶（ T）配制的。其中氨基喋呤（ A）能阻斷 DNA合成的主要途徑。 ? 骨髓瘤細胞因是 HGPRT缺失型，無 DNA合成的補償途徑，因此瘤細胞和瘤 瘤融合細胞因不能合成DNA而死亡。 ? 而 B細胞和 BB融合細胞在這樣的離體組織培養(yǎng)條件下，無法生存幾天內(nèi)亦迅速死亡。 ? 骨髓瘤細胞是 HGPRT（磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）缺陷型，但 B細胞中有這種酶，因此 B瘤融合的雜交瘤細胞含有 HGPRT酶，可利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶（ T）來合成 DNA，使雜交瘤細胞得以生長。 ? （ 2）選擇性培養(yǎng)的基本方法 ? ①將融合反應(yīng)后的細胞懸浮液于 HAT培養(yǎng)液，加入到含有飼養(yǎng)細胞的 96孔板內(nèi)（ ）。 ? ② 7天內(nèi)用 HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，每 2~3天換液一次。換液時吸去 1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。 ? ③第 7~14天改用 HT培養(yǎng)液， 14天以后用普通的 RPMI 1640完全培養(yǎng)液。 ? ④融合后培養(yǎng)的第 9~11天，就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清液進行抗體檢測，篩出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。 ? （ 3）飼養(yǎng)細胞，促進融合細胞的生長。 ? 單個或少數(shù)雜交瘤細胞多半不易存活，通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖。 ? 常用飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞（未經(jīng)免疫的脾細胞）和胸腺細胞等。 ? 飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細胞還具有清除死亡細胞和減少支原體污染的作用。 ? （七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽性克?。┑蔫b定與檢測 ? 經(jīng)培養(yǎng)而得到的雜交瘤細胞，只有一部分細胞可能產(chǎn)生針對特異抗原的目的抗體，因抗體產(chǎn)生細胞只占所有脾細胞的 5%左右。 ? 因此，在培養(yǎng) 9~11天左右，雜交瘤細胞集落直徑達 1mm時，就應(yīng)對其能否分泌抗體進行特異性鑒定，以便對抗體分泌陽性的雜交瘤細胞進行克隆化和擴張。 ? 檢測時，取上清液的一半體積用于抗體測定，其余再補加等量的 HT完全培養(yǎng)基。 ? 鑒定與檢測方法的要求 ? 應(yīng)快速、靈敏、特異性（專一性）強、微量、簡便并一次能檢測大批標本。 ? 常用的檢測方法有 ? ①、抗原直接結(jié)合法：適用于檢測能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合的抗體。 ? ②利用第二抗體檢測的方法：適用于檢測能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合的抗體。 有酶聯(lián)免疫法，放射免疫法，免疫電鏡技術(shù)，免疫熒光技術(shù)。 ? （ 1）抗原直接結(jié)合法 ? ①選取相應(yīng)的純一抗原，用 125I進行標記，然后和雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液混合，在一定溫度下反應(yīng)一定時間（如 4℃ ， 1h等） ? ②再通過活性炭吸附、 PEG 6000沉淀
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