【文章內(nèi)容簡介】 交 的方法進(jìn)行 基本流程： 組織或細(xì)胞 → 基因組 DNA→ 限制性內(nèi)切酶消化 →瓊脂糖凝膠電泳 → 印跡轉(zhuǎn)移至濾膜 → 加入探針 →雜交 → 洗膜 → 放射自顯影 → 獲得反映個體特異性的 RFLP圖譜。 RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生與檢測 所用的探針位于染色體的不同位點(diǎn)，可以作為一種分子標(biāo)記，構(gòu)建分子圖譜。 RFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)是： （ 1）遍布于整個基因組； （ 2）無表型效應(yīng) ,不受發(fā)育階段及器官特異性限制 （ 3） 共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子 ； （ 4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠； 用途： RFLP主要用于群體水平和系統(tǒng)發(fā)育研究上 .進(jìn)行個體識別；繪制遺傳圖譜；目的基因定位；檢測群體內(nèi)或群體間序列差異程度；輔助育種等。 自 RFLP問世以來，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、疾病的基因診斷等研究中得到了廣泛的應(yīng)用。 共顯性 : （兩個親本的性狀在一個個體中同時出 現(xiàn)，沒有顯隱關(guān)系） 問題 ： 1. 克隆可表現(xiàn)基因組 DNA多態(tài)性的探針較為困難 2. DNA需要量大，實(shí)驗(yàn)操作較繁鎖，檢測周期長成本費(fèi)用也很高。 3. RFLP分子標(biāo)記分布密度過于稀疏。 現(xiàn)已逐步被其他類型分子標(biāo)記所取代。 RFLP是最早發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記，也被稱為第一代分 子標(biāo)記。 2. 簡單序列長度多態(tài)性 (simple sequence length polymorphism, SSLP) 1) 可變排列的簡單重復(fù)序列 , 即重復(fù)次數(shù)不一 , 在染色體的同一座位重復(fù)序列拷貝數(shù)不同 。 2) SSLP的類型 : 小衛(wèi)星序列 (minisatellite), 有時又稱可變串聯(lián) 重復(fù)（ VNTR），重復(fù)單位較長。 重復(fù)序列為 16100個核苷酸，主要分布在染色體末端 微衛(wèi)星序列 (micrisatellite), 或稱簡單串聯(lián)重 復(fù)（ STR），重復(fù)單位較短。 重復(fù)序列只有 26個核苷酸，分布在整個基因組。 微衛(wèi)星序列（ SSR） 共顯性 如何檢測 SSR 根據(jù)簡單重復(fù)順序兩側(cè)的序列設(shè)計引物 , 經(jīng) 聚丙烯胺凝膠電泳 分辯 . SSR技術(shù)的 優(yōu)點(diǎn)是 ： （ 1）在基因組中隨機(jī)分布，檢測的多態(tài)性頻率高； （ 2） PCR特異引物，重復(fù)性好； （ 3）共顯性，操作相對簡單。 問題是 ： （ 1） SSR需要測序和設(shè)計引物，因而需要大量 的人力、物力和時間； （ 2）另外其種屬特異性強(qiáng)，開發(fā)所需的費(fèi)用高 昂，因此一些實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了合作，共同開 發(fā)微衛(wèi)星引物。 利用 SSR標(biāo)記的關(guān)鍵是引物的設(shè)計 對于已經(jīng)進(jìn)行基因組全序列測定的生物或遺傳學(xué)研究比較經(jīng)典的生物，可以直接從其基因組進(jìn)行查找和利用有關(guān)程序進(jìn)行引物的設(shè)計或利用別人已經(jīng)發(fā)表的引物來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)； 而對于沒有基因組序列信息的生物，就需要進(jìn)行有關(guān)引物的設(shè)計工作。 微衛(wèi)星序列標(biāo)記研究 1) 1982年 Hamada等首次報道 microsatrllite現(xiàn)象 (PNAS, 79:6564, 1982) 2) 1989年 Weber等從 GenBank中發(fā)現(xiàn)人類基因組的 8個位點(diǎn)中 , 有 7個位點(diǎn)存在 (CA)n拷貝數(shù)的變化 (., 44:388, 1989). 3) 現(xiàn)已證實(shí)人和老鼠基因組中平均每 1828 kb含有一個多態(tài)性 (CA)n. 4) 獲取方法 : a) 機(jī)算機(jī)搜尋 。 b) 用限制酶酶切基因組 DNA, 構(gòu)建 DNA文庫。合成簡單寡聚重復(fù)核苷酸作為探針從庫中篩選 . SSLP標(biāo)記在基因組中的分布具有多態(tài)性頻率高以及分布比較均勻的特點(diǎn)，此外 SSLP標(biāo)記可以采用 PCR方法直接擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯胺凝膠電泳分辯，現(xiàn)已成為主流的分子標(biāo)記， 又稱為第二代分子標(biāo)記。 SSR標(biāo)記應(yīng)用 ：現(xiàn)已證明微衛(wèi)星 DNA 存在于絕大多數(shù)真核生物基因組中，因此已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種純度檢測及遺傳多樣性分析、重要性狀基因的定位等。 3. SNP(單核苷酸多態(tài)性 ) SNP是指 同一物種不同個體基因組 DNA的等位序列上單個核苷酸存在差異的現(xiàn)象。 其中最少一種在群體中的頻率不小于1％；如果出現(xiàn)頻率低于 1％，則視作點(diǎn)突變。 SNP只涉及單個堿基的變異，這種變異可以由單個堿基的轉(zhuǎn)換（包括 C與 T互換， G與 A互換），或顛換（包括 C與 A、 G與 T、 C與 G、 A與 T互換）引起。 根據(jù) SNP在基因中的位置， SNP可分為： 基因編碼區(qū) SNP（ coding SNP, cSNP） 基因周邊 SNP（ peripheral SNP, pSNP） 基因間 SNP （ intronicSNP, iSNP） 從對生物的遺傳性狀的影響， cSNP又可分為兩種： cSNP(synonymous cSNP)： SNP引起的編碼序列的改變并不影響其翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列 。 2. 非同義 cSNP（ nonsynonymous cSNP） ：指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。 SNP標(biāo)記可用 DNA芯片技術(shù)檢測：將不同的寡核苷酸固定在芯片上，標(biāo)記待測 DNA，一次就可檢測很多 SNP標(biāo)記。 盡管單一的 SNP所提供的信息量遠(yuǎn)小于現(xiàn)在常用的分子標(biāo)記，但 SNP的數(shù)量極其豐富，并且可以自動化檢驗(yàn)，因此其具有廣泛的應(yīng)用前景。 SNP數(shù)量比微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)要高出幾個數(shù)量級。 例如： 3－ 4個 SNP這種相鄰的界標(biāo)構(gòu)成的單體型（ haplotype）就可以有 8－ 16種： Haplotype:又稱“單倍型”，“單元型”。一條同源染色體上的等位基因或