綠色熒光蛋白ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-08 03:02 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 擊形成第 5 位碳原子咪唑基 , Tyr 66的 α2β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團與咪唑基結(jié)合。這樣 , GFP 分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團 , 該過程可以自動催化完成。 綠色熒光蛋白的發(fā)光基團 Stereo view of the fluorophore and its environment. His148, Gln94 and Arg96 can be seen on opposite ends of the fluorophore and probably stabilize resonant forms of the fluorophore. Charged, polar, and nonpolar side chains all contact the fluorophore in some way. 綠色熒光蛋白的發(fā)光基團 His48 Gln94 Arg96 Model of the fluorophore and its environment superposed on the MADphased electron density map at 197。 resolution. The clear definition throughout the map allowed the chain to be traced and side chains to be well placed. The density for Ser65, Tyr66 and Gly67 is quite consistent with the dehydrotyrosine imidazolidone structure proposed for the fluorophore. Many of the side chains adjacent to the fluorophore are labeled. 綠色熒光蛋白的發(fā)光基團 目前對 GFP的熒光發(fā)光機制還不清楚， Morise等人曾提出一個能量傳遞模式圖來解釋水母的發(fā)光機制，但并未獲得認同。 Chattoaj等對 GFP進行了光譜分析，結(jié)合前人工作提出， GFP有兩個明顯的吸收帶，對應(yīng)于 GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài) A和 B?；鶓B(tài) A對應(yīng)于 395nm的吸收峰，基態(tài) B對應(yīng)于 475nm的吸收峰，基態(tài) A占優(yōu)勢，基態(tài) B的分子數(shù)量約是基態(tài) A的 1/6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài) (*)之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移， A*快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應(yīng)該存在一個中間過度態(tài) I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使 A*轉(zhuǎn)變成 I*, I*回遷到基態(tài) I時產(chǎn)生發(fā)射峰 504nm的熒光，構(gòu)象改變使 I*轉(zhuǎn)變成 B*，由 B*到 B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對于 GFP的作用機理較為認同的僅僅是： GFP是生物發(fā)光過程中的能量受體，并且是最終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機制各不相同，不同的突變體發(fā)光機制也有很大差異。 綠色熒光蛋白的發(fā)光機制 475nm 504nm 綠色熒光蛋白的發(fā)光機制 ? 在離體狀態(tài)下 GFP對高溫 (70OC)、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數(shù)普通酶 (鏈霉蛋白酶除外 )有較強抗性 ? GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。 ? 但因為 GFP不是酶，熒光信號沒有酶學(xué)放大效果，因此 GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。 ? 由于 GFP熒光是生物細胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此 GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白 ,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。 GFP的其他生化特性 GFP作為標記蛋白的優(yōu)點 ① 熒光穩(wěn)定 ② 檢測方便 ③ 無種屬特異性，也無有細胞種類和位置的限制 ④ GFP對受體細胞基本無毒害 ⑤ 易于構(gòu)建載體，不受假陽性干擾 ⑥ 不需任何反應(yīng)底物和輔助因子 ⑦ 可制成永久標本 ⑧ 靈敏度高 GFP基因的改進 ? 更換 GFP生色團氨基酸 ? 改變堿基組成 ? 除去 GFP基因中隱蔽剪接位點 ? 插人植物內(nèi)含子 ? 更換強啟動子等突變體 GFP ? 對密碼子進行優(yōu)化修飾 ? 增加熒光強度和熱穩(wěn)定性，促進了生色團的折疊 Zolotukhin等（ 1996）改變了 wtGFP基因編碼區(qū)中 88個密碼子中的 92個堿基而用人類基因組中常用的密碼子代替，將 GFP的熒光強度提高 22倍，適合在哺乳動物細胞中高效表達。 人工 GFP Guohong Zhang等（ 1996）將 GFP的熒光強度提高了 35倍，轉(zhuǎn)染 16h~24h后仍可穩(wěn)定地測定熒光。 增強型 GFP 將 wtGFP中的 Ser65用 Thr替代，得到突變體。 S65TGFP，激發(fā)譜 中只有一個峰，且紅移至 490nm，用藍光即可激發(fā) RSFP，使之更適于普通熒光顯微鏡觀察。 紅移熒光蛋白 雙突變體 Y66H/Y145F能在 381nm光的激發(fā)下產(chǎn)生 445nm的藍光，故稱 BFP。這種藍光能進一步激發(fā) GFP產(chǎn)生綠光，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（ FRET） 。 藍色熒光蛋白 EBFP：增強藍色熒光蛋白； ECFP：增強藍綠色熒光蛋白 EGFP：增強綠色熒光蛋白； EYFP：增強黃色熒光蛋白 綠色熒光蛋白變異體的發(fā)色基團結(jié)構(gòu) 基于 GFP的傳感器 一種被修飾過的用來感應(yīng)鋅離子濃度的藍色熒光蛋白：當(dāng)紅色的鋅離子連接到藍色的被修飾過的發(fā)色團上后，蛋白質(zhì)會發(fā)出亮度增強一倍的熒光從而形成容易被檢測到的可見信號。 Crystal structure of a Cubound green fluorescen
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