基因敲除新技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-08 03:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 tTALEN切割效率檢測 TALEN切割效率檢測 啟動子 – ABCDEF – stopTarget site DEFHIJK 啟動子 – ABCDEFHIJK 共轉(zhuǎn)染 熒光素酶檢測質(zhì)粒 + TALEN質(zhì)粒 1 + TALEN質(zhì)粒 2 熒光素酶檢測法 發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究。 有文獻表明，發(fā)光倍數(shù)達 2倍即可有效獲得突變體。 突變體篩選 ? 有限稀釋法獲得單細胞克隆 ? PCR酶切法鑒定 ? PCR測序確認 基本工具質(zhì)粒 14 – 18bp靶點序列 怎樣做 TALEN ? 1單元模塊質(zhì)粒： A， G， C, T共 4種 ? 2單元模塊質(zhì)粒： 4X4=16種 ? TALEN表達載體：基于 PCS2質(zhì)粒 2種 怎樣做 TALEN 康 為 T A L E N 定 制 質(zhì) 粒 產(chǎn) 品 1單元模塊質(zhì)粒 A, G, C, T 4種選擇 2單元模塊質(zhì)粒 共 16種選擇 pCS2 TALEN真核表達載體 TALEN空載體 2種 /套 1+2單元模塊質(zhì)粒套裝 4+16+2共 22種質(zhì)粒 /套 多單元模塊質(zhì)粒 20以下任意單元數(shù)目 pCS2 TALEN真核表達質(zhì)粒 將指定 TALEN模塊插入 pCS2 TALEN真核表達載體 怎樣做 TALEN 康 為 T A L E N 技 術(shù) 服 務(wù) TALEN質(zhì)粒構(gòu)建 提供兩個測序證明的 1418堿基 TALEN識別域真核表達克隆 (pCS2)。且以 293T細胞系轉(zhuǎn)染， PCR酶切鑒定，灰度掃描定量證實突變效率高于 10% TALEN靶向敲除細胞系構(gòu)建 提供經(jīng)克隆測序證明的目標基因移碼突變細胞系 (雜合子） TALEN靶向敲除斑馬魚構(gòu)建 提供目標基因基因移碼突變 F1斑馬魚（雜合子） TALEN技術(shù)成功率影響因素 ? 重組 TALEN模塊與靶位點的 ‘親合力’ ? 靶點序列設(shè)計原則來自 20個天然 TLAE的統(tǒng)計規(guī)律 ? 細胞系固有特性 ? K562容易， 293中等， MC10困難 ? 細胞轉(zhuǎn)染效率 ? 不同細胞系轉(zhuǎn)染效率不同， 293高， HeLa低 ? 所期待的目標 ? Heterozygous？ Homozygous？ Exact point mutation？Selection marker insertion？ TALE技術(shù)應(yīng)用范圍 ? 細菌：尚無報道，已另有多種高效靶向技術(shù)。 ? 真菌：有報道， TALE原理可行。 ? 植物： TALE原理發(fā)現(xiàn)于植物，需特定轉(zhuǎn)基因技術(shù)。 ? 動物細胞： TALE原理可行，各細胞系效率不一。 ? 斑馬魚：有 TALEN基因敲除報道，尚無點突變與敲入報道。 ? 小鼠、大鼠 ……原理肯定可行，但尚無報道（技術(shù)太新，轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建實驗周期較長）。 TALEN應(yīng)用擴展的技術(shù)關(guān)鍵： ? 切實可靠的表達系統(tǒng)。 ? 高效的轉(zhuǎn)基因及克隆篩選技術(shù)。 TALEN的植物應(yīng)用 Ting Li et. al. Highefficiency TALENbased gene editing produces disease resistant rice， volume 30 number 5 may 2022 Nature Biotechnology ? 背景 ? 水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)導(dǎo)致細菌性白葉枯病。 ? 細菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 與水稻 Os11N3基因 啟動子結(jié)合，調(diào)控（ hijack）此基因上調(diào)表達，促進細胞內(nèi)糖份向細胞外轉(zhuǎn)運，便于病原菌利用。 ? 策略 ? 以 TALEN對細菌 TALE
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