《基因敲除新技術(shù)》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 熒光素酶檢測(cè)質(zhì)粒 + TALEN質(zhì)粒 1 + TALEN質(zhì)粒 2 熒光素酶檢測(cè)法 發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究。由于在此修過(guò)程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。因 FokI需形成 2聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（ 14 18個(gè)堿基）分別進(jìn)行 TAL識(shí)別模塊構(gòu)建。 ? 一篇人類(lèi)干細(xì)胞 《 Geic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 ? 一篇大鼠 《 Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》 ? 兩篇斑馬魚(yú) 《 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《 Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 ? 一篇綜述 《 Move over ZFN》 TALEN的最前沿 TALEN靶向（基因敲除）技術(shù) 基本流程 1. 選擇、確定靶點(diǎn) 2. TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建 3. TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 4. TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細(xì)胞，表達(dá) TALEN重組蛋白 5. 檢測(cè)突變效率，篩選（移碼）突變體 X 2 X 2 X 2 Mut靶點(diǎn)的 DNA序列特征： 相隔 1718bp的兩段 1418bp序列作為靶點(diǎn) 參考文獻(xiàn)： Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effectorbased constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2022, Vol. 39, No. 12, e82. 在線靶點(diǎn)選擇設(shè)計(jì)軟件： 選擇確定 TALE靶點(diǎn) ? TAL的核酸識(shí)別單元為 34aa模塊中的雙連氨基酸（ RVD） ? RVD與 A、 G、 C、 T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即 NI識(shí)別 A， NG識(shí)別 T，HD識(shí)別 C， NN識(shí)別 G，非常簡(jiǎn)單明確 ? 欲使 TALEN特異識(shí)別某一核酸序列（靶點(diǎn)），只須按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng) TAL單元（ 14 18個(gè)）串聯(lián)克隆即可。 ? 1989年 植物病原體 黃單胞菌屬 （ Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。 ZFN 技術(shù) 鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除 研究人員可以利用 ZFN技術(shù)進(jìn)行各種基因編輯，比如基因敲除。 ? 鋅指結(jié)構(gòu)中每一個(gè) α螺旋可以特異識(shí)別34個(gè)堿基； ? 人工設(shè)計(jì)識(shí)別特異 DNA序列的 α螺旋采用如上的通用序列，通過(guò)改變其中 7個(gè)X來(lái)實(shí)現(xiàn)識(shí)別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個(gè)螺旋間的連接序列； ? 構(gòu)建成對(duì)人工鋅指結(jié)構(gòu)域和 FokI融合蛋白（ ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。 技術(shù)原理： 表達(dá)一個(gè)重組核酸酶，在靶點(diǎn)識(shí)別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識(shí)別靶點(diǎn)核酸序列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標(biāo)基因，完成基因敲除的過(guò)程。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體 TALEN介導(dǎo)的同源重組 同源重組發(fā)生率升高幾個(gè)數(shù)量級(jí) Donor plasmid HR Donor plasmid Left arm Right arm Donor plasmid Left arm Right arm 點(diǎn)突變 片段刪除 基因敲入 2022年 8月
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