遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-06-03 02:27 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 A 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 ，加 2 CTAB抽提緩沖液 65℃水浴保溫 30 min以上； ∶ 異戊醇（ 24∶ 1）； 3. 12022 rpm，室溫，離心 10~20 min； 2/3體積的經(jīng) 20℃ 預(yù)冷的異丙醇； DNA沉淀用 70%乙醇洗滌； DNA沉淀溶于適量 TE（ ）緩沖液中； DNA溶液在 %的瓊脂糖凝膠上電泳分離并在凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察。 五、作業(yè) 分析電泳結(jié)果，解釋原因。 附 2 DNA濃度的測定 一、實(shí)驗(yàn)材料 所提取的水稻 DNA母液。 二、實(shí)驗(yàn)器具和藥品 1．用具： 7522紫外分光光度計(jì)、取樣器 2．藥品：雙蒸餾水、 TE 三、操作步驟 1．講解和練習(xí)分光光度計(jì)的使用方法 2．取 20ml提取的核 DNA，加入 1980ml蒸餾水對待測DNA樣品做 1:100(或更高倍數(shù)的稀釋 )。 3．蒸餾水作為空白 ,在波長 260nm、 280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)至零。 4．加入 DNA稀釋液，測定 260nm 及 280nm的吸收值。260nm 讀數(shù)用于計(jì)算樣品中核酸的濃度， OD260值為 1相當(dāng)于約 50mg /ml雙鏈 DNA， 33mg /ml單鏈?？筛鶕?jù)在 260nm以及在 280nm的讀數(shù)的比值（ OD260/OD280）估計(jì)核酸的純度。一般 DNA的純品，其比值為 ，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染。 5．記錄 OD值，通過計(jì)算確定 DNA濃度或純度，公式如下 : dsDNA（ mg /ml） =50 (OD260) 稀釋倍數(shù) 附 3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）實(shí)驗(yàn) 一、基本原理 雙鏈 DNA分子經(jīng)高溫變性后成為兩條單鏈 DNA（ 模板 DNA），單鏈 DNA在互補(bǔ)寡聚核苷酸片段（ 引物 ）的引導(dǎo)下，可以利用 DNA多聚酶按5` 3`方向復(fù)制出互補(bǔ) DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ polymerase chain reaction）的原理類似于 DNA的天然復(fù)制過程。在緩沖液中有引物、 DNA合成底物 dNTP存在下，經(jīng)變性、退火和延伸即可合成產(chǎn)物 DNA。經(jīng)若干個(gè)這樣的循環(huán)后， DNA即可擴(kuò)增2n倍。具體過程如下： 變性：加熱使模板 DNA在高溫（ 94oC）下變性，雙鏈中的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。 退火：使溶液溫度逐漸降至 5060 oC，模板 DNA即可與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合。 延伸：再將溶液反應(yīng)溫度升至 72 oC，耐熱 DNA聚合酶以單鏈 DNA為模板，在引物引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的 4種脫氧核苷酸（ dNTP），按5` 3`方向復(fù)制出互補(bǔ) DNA。 上述三步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的 DNA量即可增加一倍，新形成的鏈又可成為下一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過 2530個(gè)循環(huán)后， DNA可擴(kuò)增106109倍。 二、實(shí)驗(yàn)器材 PCR熱循環(huán)儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、加樣槍、槍頭、離心管。 三、材料與試劑 1） DNA模板： ，使用前用 TE緩沖液或ddH2O稀釋 10倍置于冰中。 2） 4種脫氧核苷酸（ dNTP）： 4倍 dNTP，即 1mmol/L dNTP 、1mmol/L dATP 、 1mmol/L dCTP 、 1mmol/L dGTP 、1mmol/L dTTP 。 3） 50nmol/L 引物： ISSR第 808號(hào)引物： AGAGAGAGAGAGAGAGC ISSR第 812號(hào)引物： GAGAGAGAGAGAGAGAA 4） 5） DNA 標(biāo)記（ Marker） 6） 10X PCR反應(yīng)緩沖液：含有 500mmol/L KCl、 100mmol/L HCl()、 15mmol/L Mg2Cl、 %(W/V)明膠、 1%Triton X100。 7 ） DNA瓊脂糖凝膠電泳全部試劑 四、操作步驟 1） Eppendorf管一個(gè)，反應(yīng)總體積 20ul,用加樣槍按以下順序分別加入各種試劑： 反應(yīng)物 體積（ ul） ddH2O 10X buffer 2 Mg2+ dNTP 1 primer Taq DNA模板
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