【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2O分別置于 450ml蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之溶解，然后將 2種溶液混合，把 pH調(diào)到 ，加蒸餾水至 1L，可配成100倍或 200倍母液。 （ 4）有機(jī)化合物母液 ? 主要是維生素和氨基酸類(lèi)物質(zhì)，可配制成 100 或 200 。 （ 5）植物激素 ? 每種激素必須單獨(dú)配制成母液，濃度為每毫升含 、 、 ，用時(shí)根據(jù)需要取用，激素一般濃度表示方法為 mg/ml。 ? 1）融化瓊脂 稱(chēng)出規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖，加水到培養(yǎng)基最終體積的 2/3，加熱使之溶解。 ? 2）混合培養(yǎng)基中各成分，依次加入大量、微量、鐵鹽和有機(jī)成分。 ? 3）加蒸餾水至培養(yǎng)基的最終容積。 ? 4）用 pH計(jì)或 pH試紙測(cè) pH值，并用。 ? 5）分裝 將配制好的培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)容器內(nèi)，并用棉篩或封口膜封好瓶口。 ? 6）滅菌 用高溫高壓滅菌，一般在121℃ 下滅菌 15～ 20min。 ? 7）放置備用 使培養(yǎng)基在室溫下冷卻，置冰箱中 4℃ 保存。 Chapter 4 外植體 植物體的各個(gè)部位，如根、莖、葉、花瓣、花藥、胚珠、塊莖、莖尖、維管組織、髓部等。 植物種類(lèi)不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理狀態(tài)，對(duì)外界誘導(dǎo)反應(yīng)能力及分化再生能力不同 。 一、外植體種類(lèi) 植物基因型 植物基因型不同，組織培養(yǎng)的難易程度不同，草本植物比木本植物易于通過(guò)組織培養(yǎng)獲得成功，雙子葉植物比單子葉植物易于組織培養(yǎng)。 選擇適宜的外植物，首先要對(duì)材料的選擇有明確的目的，選取優(yōu)良的或特殊的具有一定代表性的基因型，這樣可提高成功率，增加其實(shí)用價(jià)值。 外植體來(lái)源 從田間或溫室中生長(zhǎng)健壯的無(wú)病蟲(chóng)害的植株上選取發(fā)育正常的器官或組織作外植體，離體培養(yǎng)易于成功。 同一植物不同部位之間的再生能力差別較大。 最好對(duì)所要培養(yǎng)的植物各部位的誘導(dǎo)及分化能力進(jìn)行比較，從中篩選合適的、最易再生的部位作為最佳外植體。 莖尖是較好的外植體。 外植體大小 外植體的大小，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的而定。外植體過(guò)大，殺菌不徹底，易于污染；過(guò)小，離體培養(yǎng)難于成活。一般外植體大小在 ～ 。 取材季節(jié) 離體培養(yǎng)的外植體最好在植物生長(zhǎng)的最適時(shí)期取材，即在其生長(zhǎng)開(kāi)始的季節(jié)采樣，若在生長(zhǎng)末期或已經(jīng)進(jìn)入休眠期取樣，則外植體會(huì)對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無(wú)反應(yīng)。 外植體的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡 外植體的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡直接影響離體培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)發(fā)生。一般情況下，越幼嫩，年限越短的組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力，組織培養(yǎng)越易成功。 （ 1）選擇優(yōu)良的種質(zhì) 無(wú)論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)，或特殊的基因型。對(duì)材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高成功機(jī)率，增加其實(shí)用價(jià)值。 ＊ 材料選取的原則 （ 2）選擇健壯的植株 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長(zhǎng)健壯的無(wú)病蟲(chóng)的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織；要在晴天，最好是中午或下午取材料，絕不要在雨天、陰天或露水未干時(shí)取樣。因?yàn)榻训闹仓旰颓缣旃夂虾粑x旺盛的組織有自身消毒作用，再生能力強(qiáng)，比較容易培養(yǎng)成功。 （ 3）選擇最適的時(shí)期 組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長(zhǎng)季節(jié)和植物的生長(zhǎng)發(fā)育階段。如快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長(zhǎng)的最適時(shí)期取材，這樣不僅成活率高，而且生長(zhǎng)速度快，增殖率高；花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期時(shí)取材，這時(shí)比較容易形成愈傷組織。 （ 4）選取適宜的大小 建立無(wú)菌材料時(shí)，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在 ~。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。 （ 5）選取適宜的消毒劑 完全地殺死材料表面的微生物，表面消毒的基本要求是既要?dú)⑺啦牧媳砻嫒课⑸铮忠粋Σ牧?，選用適當(dāng)?shù)南緞?、合適的濃度和處理時(shí)間，靈活掌握和使用。 二、外植體接種 外植體接種（ explant inoculation）： 是把經(jīng)過(guò)表面消毒后的植物材料在超凈工作臺(tái)上切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，并將它 們轉(zhuǎn)放到無(wú)菌培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程。 整個(gè)接種過(guò)程均須無(wú)菌操作。操作過(guò)程中引起的污染，主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應(yīng)特別注意防止工作人員本身引起的污染。 外植體接種操作 1）入無(wú)菌室前要用肥皂洗手，去掉指甲中污物； 2）入室時(shí)要穿上經(jīng)過(guò)消毒的工作服、帽子、口罩、鞋子等； 3）操作前要用 70%酒精擦洗工作人員手，操作中要經(jīng)常用 70%酒精擦手和臺(tái)面。特別注意防止 “ 雙重傳遞 ” 的污染，例如器械被手污染后又污染培養(yǎng)基等。 4）在打開(kāi)培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時(shí)，最大的污染危險(xiǎn)是管口邊沿沾染的微生物落入管內(nèi)，解決這個(gè)問(wèn)題，必須在酒精燈火焰處進(jìn)行操作，可在打開(kāi)前用火焰燒瓶口，蓋瓶蓋前將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上燒一下，然后蓋上。 如果培養(yǎng)液接觸了瓶口，則瓶口要燒到 足夠的熱度，以殺死存在的細(xì)菌。為避免灰塵污染瓶口，可用紙包扎瓶口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對(duì)地減少污染機(jī)會(huì)。 5）每次重新操作前都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。 6）工作人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在平靜呼吸時(shí)細(xì)菌是很少的，但是談話(huà)或咳嗽時(shí)細(xì)菌便增多，因此操作過(guò)程應(yīng)禁止不必要的談話(huà)并戴上口罩。 7）由于空氣中有灰塵，因此在操作時(shí)，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當(dāng)打開(kāi)瓶子或試管時(shí)，應(yīng)拿成斜角，以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等用具，一般在使用前浸泡在 95%酒精中，用時(shí)在火焰上消毒，待冷卻后使用。每次使用前均需進(jìn)行用具消毒。 三、培養(yǎng)條件 接種后的外植體應(yīng)送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一就是在人工控制的環(huán)境條件下，使培養(yǎng)物生長(zhǎng)發(fā)育，研究植物的生命活動(dòng)。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對(duì)環(huán)境條件的不同需求進(jìn)行調(diào)控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣和培養(yǎng)基的 pH值等。 光照 通常對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)，在黑暗條件下有利，在有光條件下培養(yǎng)的愈傷組織質(zhì)地和顏色也有不同。但分化器官需要光照，并隨著芽苗的生長(zhǎng)需要加強(qiáng)光照。加強(qiáng)光照，可以使小苗生長(zhǎng)健壯，促進(jìn) “ 異養(yǎng) ” 向 “ 自養(yǎng) ”轉(zhuǎn)化，提高移植的成活率。 普通培養(yǎng)室要求每日光照 12h16h，光照強(qiáng)度 1000 lx5000lx。如果培養(yǎng)材料要求在黑暗中生長(zhǎng)，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周?chē)?，或置于暗室中培養(yǎng)。 溫度 離體培養(yǎng)中對(duì)溫度的調(diào)控要比光照顯得更為突出。不同的植物有不同的最適生