【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 養(yǎng)的要求。流化床反應(yīng)器可用于貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。另外，流化床反應(yīng)器放大也比較容易，放 大效應(yīng)小，已成功地從 放大至 10L，用于培養(yǎng)同種細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體，體積生產(chǎn)率基本一致。 （四）攪拌罐生物反應(yīng)器 (stirtank bioreactor) 第 9 頁(yè) 共 22 頁(yè) 攪拌罐生物反應(yīng)器基本結(jié)構(gòu)為：一個(gè)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器、一臺(tái)用于控制溫度、 pH 值、攪拌速度和溶氧 (DO)的數(shù)字控制裝置 (DCU)和起通氣作用的底部環(huán)形噴氣結(jié)構(gòu)?；驹硎切迈r培養(yǎng)基分散進(jìn)入旋轉(zhuǎn)濾器的外部區(qū)域，從旋轉(zhuǎn)濾器的中間獲得無(wú)微載體的收集液。旋轉(zhuǎn)濾器一般由不銹鋼絲網(wǎng)構(gòu)成，有良好的生物相溶性，易于清洗和消毒，可重復(fù)和長(zhǎng)期使用。 在攪拌式生物反應(yīng)器中同樣可以培 養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又能培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。它主要的優(yōu)點(diǎn)是能滿足高密度細(xì)胞培養(yǎng)的要求。 CelliGen 籠式通氣攪拌罐和 20L 雙層籠式通氣攪拌罐（ CellCul20）已經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)多種細(xì)胞。 1999 年，美國(guó)人 Zhaoliec 在攪拌式生物反應(yīng)器中利用重組 CHO 細(xì)胞 4B3 生產(chǎn)了纖維蛋白溶酶原激活 . （五）堆積床生物反應(yīng)器 (packedbed bioreactor) CelligenPlus 堆積床生物反應(yīng)器的工作原理為：當(dāng)推進(jìn)器 (impeller)旋轉(zhuǎn)時(shí)，培養(yǎng)基通過(guò)推進(jìn)器的中心空管螺旋式地從罐體底部往上流，然后 從 3 個(gè)出口中流出，通過(guò)堆積床向下流動(dòng)至罐體底部，再通過(guò)推進(jìn)器的中心管往上流。細(xì)胞附著在堆積床的聚酯片上，氣體從噴射器噴出進(jìn)入培養(yǎng)基中。通過(guò)調(diào)節(jié)氣體混合物的組成成分，完成對(duì) pH 和 DO 的控制，加入氧氣或氮?dú)庖詽M足培養(yǎng)過(guò)程中氧氣的吸收；當(dāng) pH 太高時(shí)加入 CO2；空氣作為一種填充氣體，保持氣體進(jìn)入罐體時(shí)流速的穩(wěn)定。培養(yǎng)基通過(guò)蠕動(dòng)泵從培養(yǎng)基儲(chǔ)存瓶 (mediareservoir)中進(jìn)入反應(yīng)器，收集液通過(guò)蠕動(dòng)泵從反應(yīng)器中流出進(jìn)入收集瓶。堆積床有以下特點(diǎn)：貼壁依賴性和懸浮細(xì)胞可成功地在堆積床內(nèi)附著；細(xì)胞不接觸氣液界面，低漩流 和低剪切力，細(xì)胞受到的傷害很小；反應(yīng)器能以分批式或連續(xù) /灌流方式運(yùn)轉(zhuǎn)，并可維持長(zhǎng)時(shí)間 。聚酯片提供高的表面積 /體積比率，維持高細(xì)胞密度。 國(guó)內(nèi)有人采用美國(guó) NEW BRUNS WICK SCIENTIFIC 公司生產(chǎn)的Ｃ elliＧ en Ｐ lus 堆積床生物反應(yīng)器，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分泌 rhEPO 的工程細(xì)胞株ＸＰ 9501，用于大規(guī)模生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素。 （六）一次性生物反器 (disposable bioreactor) 這種生物反應(yīng)器由預(yù)先消毒的、 FDA 認(rèn)可的、對(duì)生物無(wú)害的聚乙烯塑料箱組成，箱中部分填充培養(yǎng)基 并接種細(xì)胞。箱中其余部分是空的，培養(yǎng)過(guò)程中空氣連續(xù)通過(guò)這里，空氣通過(guò)完整的過(guò)濾器進(jìn)入箱體。前后搖動(dòng)箱體使液氣界面產(chǎn)生波動(dòng)，大大提高了氧氣的溶解量，有利于排出 CO2，控制 pH 值，也促使培養(yǎng)液混合均勻，細(xì)胞和顆粒不會(huì)下沉。廢氣通過(guò)一個(gè)消毒過(guò)濾器和止逆閥。整個(gè)生物反應(yīng)器置于傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)用 CO2 培養(yǎng)箱中，便于控制溫度和 pH 值，或者在箱體底部加熱控制溫度。培養(yǎng)細(xì)胞的密度可達(dá)到 7 106mL1 和 100L的工作體積 .使用前箱體用γ射線消毒，用后丟棄。特殊的開孔可進(jìn)行無(wú)菌加樣、取樣，而不必把生物反應(yīng)器置于層流罩中。裝置 簡(jiǎn)單，易于操作，成本低，低剪切力，無(wú)空氣鼓泡，減低了氣泡對(duì)細(xì)胞的損害?？捎糜谂囵B(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞，并十分適合生產(chǎn)病毒。此反應(yīng)器已成功懸浮培養(yǎng)重組 NS0 細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體；懸浮培養(yǎng)人 293 細(xì)胞生產(chǎn)腺病毒(adenovirus)；用昆蟲 sf9 細(xì)胞生產(chǎn)棒狀病毒 (baculovirus)；用微載體 Cytodex3 培養(yǎng)人 393 細(xì)胞。 第 10 頁(yè) 共 22 頁(yè) 植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體的條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的細(xì)胞，通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞 增殖，從而獲得大量的細(xì)胞群體的一種技術(shù)。植物細(xì)胞含有人類所需的成分，而傳統(tǒng)的方法從植物中提取分離這些成分已很難滿足人們的需求。近年來(lái)，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物已受到廣泛的關(guān)注，但是，只有一小部分的產(chǎn)品已成功用于商業(yè)化生產(chǎn)，其原因是反應(yīng)器設(shè)計(jì)、過(guò)程發(fā)展以及對(duì)反應(yīng)機(jī)理知識(shí)的欠缺等工藝上的限制。植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、需氧低，此外，由于它們體積較大、細(xì)胞壁較厚、液泡較大而對(duì)剪切敏感。因此氣升式和柱狀生物反應(yīng)器應(yīng)用較為普遍。隨著植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的逐步完善，單細(xì)胞培養(yǎng)的成功，各種新型生物反應(yīng)器的問(wèn)世，利用植物 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成為大規(guī)模生產(chǎn)植物代謝產(chǎn)物的有效途徑。 一、植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程 植物細(xì)胞培養(yǎng)按照培養(yǎng)對(duì)象可分為單倍體細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)；按照培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按照培養(yǎng)方式可分為懸浮培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)。 單倍體培養(yǎng) 一般是指花藥在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，從小孢子（雄性生殖細(xì)胞）直接發(fā)育成胚狀體，然后再長(zhǎng)成單倍體植株；也可以通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)分化出芽和根，最終長(zhǎng)成植株。 原生質(zhì)體培養(yǎng) 將植物的體細(xì)胞（二倍體細(xì)胞）經(jīng)纖維素酶等去掉細(xì)胞壁處理后，獲得的原生質(zhì)體（ protoplast）在無(wú)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、分 裂，最終長(zhǎng)成植株。也可以將不同植物的原生質(zhì)體融合而獲得體細(xì)胞雜交的植株。 固體培養(yǎng)是在微生物培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法。培養(yǎng)基添加一定比例的瓊脂配制，用培養(yǎng)皿、三角燒瓶或試管分裝，經(jīng)高壓滅菌冷卻凝固后接種經(jīng)消毒過(guò)的外植體，整個(gè)過(guò)程需無(wú)菌操作。 液體培養(yǎng) 也是在微生物培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，可分為靜止與振蕩兩種。靜止培養(yǎng)無(wú)需任何設(shè)備，適合某些原生質(zhì)體的培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)需要搖床或轉(zhuǎn)床等設(shè)備，可使培養(yǎng)物充分混合以利于氣體交換。 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 是一種使組織培養(yǎng)物分離成單細(xì)胞并不斷擴(kuò)增的液體培養(yǎng)技術(shù)。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需要提供容易碎裂的愈傷組織進(jìn)行液體培養(yǎng)。與微生物培養(yǎng)相似，植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)也包括分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)（也叫流加培養(yǎng)）、連續(xù)培養(yǎng)三種方式。目前，植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)主要采用懸浮培養(yǎng)方式，這主要是由于懸浮培養(yǎng)可以增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的吸收；可帶走培養(yǎng)物產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，避免高濃度積聚對(duì)細(xì)胞的傷害；可保證良好的混合狀態(tài)，從而獲得良好的氣體傳遞效果；可以借鑒發(fā)酵工程的成熟技術(shù)，容易放大實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?。 固定化細(xì)胞培 養(yǎng) 是在微生物和酶的固定化培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。是固體培養(yǎng)的一種，但不是使用固體培養(yǎng)基，而是與固定化酶或固定化微生物細(xì)胞培養(yǎng)類似的一種植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，目前應(yīng)用最廣泛的、能很好保持細(xì)胞活性的固定化方法是將細(xì)胞包埋于海藻酸鹽或卡拉膠中。具體培養(yǎng)方法將在下一節(jié)中介紹。 （一）植物細(xì)胞培養(yǎng)基 對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)而言，培養(yǎng)基的組成成分是一個(gè)決定性的因素。植物細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相比，其最大的優(yōu)點(diǎn)是植物細(xì)胞能在簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。其培養(yǎng)基主要由無(wú)機(jī)鹽類、碳源、維生素、植物生長(zhǎng)激素、有機(jī)氮源、有機(jī)酸等組成。 1．無(wú) 機(jī)鹽類 第 11 頁(yè) 共 22 頁(yè) 對(duì)于不同的培養(yǎng)對(duì)象和形式，無(wú)機(jī)鹽的最佳濃度是不相同的。通常在培養(yǎng)基中至少含有25mmol/L的硝酸鹽和鉀。雖然硝酸鹽可以單獨(dú)作為無(wú)機(jī)氮源，但是加人一點(diǎn)銨鹽對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。如果銨鹽單獨(dú)作為氮源，添加一些琥珀酸或其他三羧酸循環(huán)酸效果更好。對(duì)常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，硝酸鹽加上銨的濃度可達(dá)到 60mmol/L，說(shuō)明銨可能對(duì)某些培養(yǎng)物有重要作用。鎂、鈣和硫元素的濃度在ｌ～３ mmol／Ｌ范圍較為合適。所需的鈉、磷和氯化物有鈣鹽、磷酸鹽和微量營(yíng)養(yǎng)物提供。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。 2．碳 源和能源 蔗糖或葡萄糖是常規(guī)的碳源，而果糖的利用效果較差。其他糖類均不合適作為單一的碳源。培養(yǎng)基中蔗糖被迅速分解為葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。大多數(shù)植物細(xì)胞對(duì)蔗糖的需求范圍是 2%到 4%。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量，可增加培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物量。 3．植物生長(zhǎng)激素 植物激素是培養(yǎng)基中不可缺少的組成部分，大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)基中都含有天然的和合成的植物生長(zhǎng)激素。通常激素可分為二類：生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。生長(zhǎng)素能促進(jìn)細(xì)胞分裂，常用的有吲哚乙酸（ IAA）、吲哚丁酸（ IBA）、 2， 4二氯苯氧基乙酸 （ 2， 4Ｄ）和萘乙酸（ NAA）。前兩種不穩(wěn)定，能被細(xì)胞釋放的酶降解，而后兩種被細(xì)胞降解的較慢，對(duì)熱穩(wěn)定。細(xì)胞分裂素常用的是 6芐基瞟憐（ 6BA），激動(dòng)素（ kt）和玉米素（ zeatin）。將分裂素和生長(zhǎng)素一起使用，效果更佳。使用量在 ~10ｍｇ／Ｌ之間，可根據(jù)不同細(xì)胞株而異。 4．維生素 在各種維生素中，硫胺素（維生素 B2）可能是必需的，而煙酸和吡哆辛（維生素 B6）對(duì)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。一般在培養(yǎng)基中都加了較多的肌醇，它能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)。 5．有機(jī)氮源 通常采用的有機(jī)氮源 有水解酪蛋白 、谷氨酰 胺或氨基酸 混合物。 在 細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)的早期生長(zhǎng)階段 ，有機(jī)氮源可促進(jìn)胚胎發(fā)生和多胚性出現(xiàn) 。 6．有機(jī)酸 在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，加人丙酮酸或者三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸等，能夠保證植物細(xì)胞生長(zhǎng)，并且耐受鉀鹽的能力也有所提高。 （二）植物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備 配制培養(yǎng)基所用的蒸餾水最好是用玻璃容器蒸餾過(guò)的去礦質(zhì)鹽的蒸餾水，所用的無(wú)機(jī)鹽、碳源、維生素應(yīng)該采用高純度級(jí)的藥品。生長(zhǎng)激素在使用前需要重結(jié)晶提純，其酒精－水溶液要用吸附法脫色處理。蛋白水解液最好用酶水解。對(duì)于吲哚乙酸、吲哚丁酸、 2， 4二氯苯氧基 乙酸和萘乙酸這樣難溶于水的生長(zhǎng)激素類物質(zhì)，配溶液時(shí)可先溶于 95%的酒精中，然后慢慢加人蒸餾水，稍微加熱，稀釋至所需體積，再調(diào)節(jié) pＨ。由于培養(yǎng)基配比中有些組分量很小，可按培養(yǎng)基配方濃度配成使用濃度的 10倍或者更多倍的母液，分成小瓶后冷凍保存，使用時(shí)再稀釋到正常濃度。為了防止在高濃度下培養(yǎng)基組分間相互作用產(chǎn)生沉淀，鈣鹽、鈉鐵鹽等要單獨(dú)配制保存，使用時(shí)再稀釋混合。維生素每種也是分開配制的。配制細(xì)胞分裂素物質(zhì)，應(yīng)先用少量濃度為 1mol/L的鹽酸來(lái)溶解，然后加蒸餾水至所需量。在培養(yǎng)基配制過(guò)程中可用 ，固體培養(yǎng)基加人瓊脂 %～％， 121℃蒸汽滅菌 15~20min。大多數(shù)培養(yǎng)基成分都經(jīng)得起高溫滅菌，對(duì)于一些熱敏性化合物，如Ｌ谷氨酰胺、植物生長(zhǎng)激素等應(yīng)該用過(guò)濾法滅菌，然后再按無(wú)菌操作加人到己滅茵的培養(yǎng)基中。 二、植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 第 12 頁(yè) 共 22 頁(yè) 與天然栽培法相比，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用代謝產(chǎn)物、食品添加劑、化妝品等具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但能成功地把搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果放大到生物反應(yīng)器中而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)的較少，可見研究合適的生物反應(yīng)器對(duì)于植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用代 謝產(chǎn)物是非常重要的。植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器最初大多采用微生物反應(yīng)器。由于植物細(xì)胞與微生物細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大，對(duì)氧需求小，對(duì)剪切力卻很敏感，因此不象微生物培養(yǎng)那樣采用高剪切的攪拌，而混合顯得更重要。目前，由于植物細(xì)胞懸浮技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞培養(yǎng)的成功，加上各種新型生物反應(yīng)器的問(wèn)世，使得植物細(xì)胞有可能像微生物那樣在發(fā)酵罐中大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)。用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器主要有攪拌式、非攪拌式及其它新型生物反應(yīng)器，另外還有植物細(xì)胞固定化反應(yīng)器和膜反應(yīng)器等。 （一）機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器 機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器 混合程度高，適應(yīng)性廣，能獲得很高的溶氧系數(shù) KLa，在大規(guī)模生產(chǎn)中廣泛使用。但是攪拌罐中產(chǎn)生的剪切力大，容易損傷細(xì)胞，且植物細(xì)胞培養(yǎng)一般只需較低的溶氧系數(shù)。因而對(duì)于有些對(duì)剪切力敏感的細(xì)胞，傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌罐并不適用。為此，對(duì)攪拌罐進(jìn)行了改進(jìn)，包括改變攪拌形式、葉輪結(jié)構(gòu)與類型、空氣分布器等，力求減少產(chǎn)生的剪切力，同時(shí)滿足供氧與混合的要求。 Kaman 等采用帶有 1 個(gè)雙螺旋帶狀葉輪(helicalribbonimpeller)和 3 個(gè)表面擋板的攪拌罐，證明適于剪切力敏感的高密度細(xì)胞培養(yǎng)。Jolicoeur 等進(jìn)行了類似的研 究，在反應(yīng)器中得到與搖瓶相同的高濃度生物量。鐘建江等通過(guò)培養(yǎng)紫蘇細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)帶以微孔金屬絲網(wǎng)作為空氣分布器的三葉螺旋槳反應(yīng)器 (MRP)能提供較小的剪切力和良好的供氧及混合狀態(tài)，優(yōu)于六平葉渦輪槳反應(yīng)器，并認(rèn)為在高濃度細(xì) 胞 培 養(yǎng) 時(shí) ， MRP 型 反 應(yīng) 器 將 顯 示 更 大 的 優(yōu) 越 性 。 離 心 式 葉 輪 反 應(yīng) 器(centrifugalimpellerbioreactor)與細(xì)胞升式反應(yīng)器 (cellliftbioreactor)相比具有較高升液能力，較低剪切力，較短混合時(shí)間，在高濃度下具有高得多的溶解氧系數(shù)，表明有用于剪切力敏感的生 物系統(tǒng)的巨大潛力。另有方框型槳式攪拌、蝶型渦輪攪拌等不同形式的機(jī)械攪拌罐用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)和研究，結(jié)果證明不同葉輪產(chǎn)生剪切力大小順序?yàn)闇u輪狀葉輪 平葉輪 螺旋狀葉輪。一種升流式生物反應(yīng)器 (lifts