【文章內容簡介】 養(yǎng)的要求。流化床反應器可用于貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。另外，流化床反應器放大也比較容易，放 大效應小，已成功地從 放大至 10L，用于培養(yǎng)同種細胞生產單克隆抗體，體積生產率基本一致。 （四）攪拌罐生物反應器 (stirtank bioreactor) 第 9 頁 共 22 頁 攪拌罐生物反應器基本結構為：一個旋轉過濾器、一臺用于控制溫度、 pH 值、攪拌速度和溶氧 (DO)的數字控制裝置 (DCU)和起通氣作用的底部環(huán)形噴氣結構。基本原理是新鮮培養(yǎng)基分散進入旋轉濾器的外部區(qū)域，從旋轉濾器的中間獲得無微載體的收集液。旋轉濾器一般由不銹鋼絲網構成，有良好的生物相溶性，易于清洗和消毒，可重復和長期使用。 在攪拌式生物反應器中同樣可以培 養(yǎng)懸浮生長的細胞，又能培養(yǎng)貼壁生長的細胞。它主要的優(yōu)點是能滿足高密度細胞培養(yǎng)的要求。 CelliGen 籠式通氣攪拌罐和 20L 雙層籠式通氣攪拌罐（ CellCul20）已經大規(guī)模培養(yǎng)多種細胞。 1999 年，美國人 Zhaoliec 在攪拌式生物反應器中利用重組 CHO 細胞 4B3 生產了纖維蛋白溶酶原激活 . （五）堆積床生物反應器 (packedbed bioreactor) CelligenPlus 堆積床生物反應器的工作原理為：當推進器 (impeller)旋轉時，培養(yǎng)基通過推進器的中心空管螺旋式地從罐體底部往上流，然后 從 3 個出口中流出，通過堆積床向下流動至罐體底部，再通過推進器的中心管往上流。細胞附著在堆積床的聚酯片上，氣體從噴射器噴出進入培養(yǎng)基中。通過調節(jié)氣體混合物的組成成分，完成對 pH 和 DO 的控制，加入氧氣或氮氣以滿足培養(yǎng)過程中氧氣的吸收；當 pH 太高時加入 CO2；空氣作為一種填充氣體，保持氣體進入罐體時流速的穩(wěn)定。培養(yǎng)基通過蠕動泵從培養(yǎng)基儲存瓶 (mediareservoir)中進入反應器，收集液通過蠕動泵從反應器中流出進入收集瓶。堆積床有以下特點：貼壁依賴性和懸浮細胞可成功地在堆積床內附著；細胞不接觸氣液界面，低漩流 和低剪切力，細胞受到的傷害很??；反應器能以分批式或連續(xù) /灌流方式運轉，并可維持長時間 。聚酯片提供高的表面積 /體積比率，維持高細胞密度。 國內有人采用美國 NEW BRUNS WICK SCIENTIFIC 公司生產的Ｃ elliＧ en Ｐ lus 堆積床生物反應器，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分泌 rhEPO 的工程細胞株ＸＰ 9501，用于大規(guī)模生產重組人促紅細胞生成素。 （六）一次性生物反器 (disposable bioreactor) 這種生物反應器由預先消毒的、 FDA 認可的、對生物無害的聚乙烯塑料箱組成，箱中部分填充培養(yǎng)基 并接種細胞。箱中其余部分是空的，培養(yǎng)過程中空氣連續(xù)通過這里，空氣通過完整的過濾器進入箱體。前后搖動箱體使液氣界面產生波動，大大提高了氧氣的溶解量，有利于排出 CO2，控制 pH 值，也促使培養(yǎng)液混合均勻，細胞和顆粒不會下沉。廢氣通過一個消毒過濾器和止逆閥。整個生物反應器置于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)用 CO2 培養(yǎng)箱中，便于控制溫度和 pH 值，或者在箱體底部加熱控制溫度。培養(yǎng)細胞的密度可達到 7 106mL1 和 100L的工作體積 .使用前箱體用γ射線消毒，用后丟棄。特殊的開孔可進行無菌加樣、取樣，而不必把生物反應器置于層流罩中。裝置 簡單，易于操作，成本低，低剪切力，無空氣鼓泡，減低了氣泡對細胞的損害?？捎糜谂囵B(yǎng)動物細胞和植物細胞，并十分適合生產病毒。此反應器已成功懸浮培養(yǎng)重組 NS0 細胞生產單克隆抗體；懸浮培養(yǎng)人 293 細胞生產腺病毒(adenovirus)；用昆蟲 sf9 細胞生產棒狀病毒 (baculovirus)；用微載體 Cytodex3 培養(yǎng)人 393 細胞。 第 10 頁 共 22 頁 植物細胞培養(yǎng)生物反應器 植物細胞培養(yǎng)是指在離體的條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞 增殖，從而獲得大量的細胞群體的一種技術。植物細胞含有人類所需的成分，而傳統(tǒng)的方法從植物中提取分離這些成分已很難滿足人們的需求。近年來，利用植物細胞培養(yǎng)來生產有用代謝產物已受到廣泛的關注，但是，只有一小部分的產品已成功用于商業(yè)化生產，其原因是反應器設計、過程發(fā)展以及對反應機理知識的欠缺等工藝上的限制。植物細胞生長緩慢、需氧低，此外，由于它們體積較大、細胞壁較厚、液泡較大而對剪切敏感。因此氣升式和柱狀生物反應器應用較為普遍。隨著植物細胞懸浮培養(yǎng)技術的逐步完善，單細胞培養(yǎng)的成功，各種新型生物反應器的問世，利用植物 細胞培養(yǎng)技術成為大規(guī)模生產植物代謝產物的有效途徑。 一、植物細胞培養(yǎng)過程 植物細胞培養(yǎng)按照培養(yǎng)對象可分為單倍體細胞培養(yǎng)和原生質體培養(yǎng)；按照培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按照培養(yǎng)方式可分為懸浮培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。 單倍體培養(yǎng) 一般是指花藥在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，從小孢子（雄性生殖細胞）直接發(fā)育成胚狀體，然后再長成單倍體植株；也可以通過愈傷組織誘導分化出芽和根，最終長成植株。 原生質體培養(yǎng) 將植物的體細胞（二倍體細胞）經纖維素酶等去掉細胞壁處理后，獲得的原生質體（ protoplast）在無菌培養(yǎng)基上生長、分 裂，最終長成植株。也可以將不同植物的原生質體融合而獲得體細胞雜交的植株。 固體培養(yǎng)是在微生物培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的植物細胞培養(yǎng)的方法。培養(yǎng)基添加一定比例的瓊脂配制，用培養(yǎng)皿、三角燒瓶或試管分裝，經高壓滅菌冷卻凝固后接種經消毒過的外植體，整個過程需無菌操作。 液體培養(yǎng) 也是在微生物培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的，可分為靜止與振蕩兩種。靜止培養(yǎng)無需任何設備，適合某些原生質體的培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)需要搖床或轉床等設備，可使培養(yǎng)物充分混合以利于氣體交換。 細胞懸浮培養(yǎng) 是一種使組織培養(yǎng)物分離成單細胞并不斷擴增的液體培養(yǎng)技術。在進行細胞培養(yǎng)時需要提供容易碎裂的愈傷組織進行液體培養(yǎng)。與微生物培養(yǎng)相似，植物細胞的懸浮培養(yǎng)也包括分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)（也叫流加培養(yǎng)）、連續(xù)培養(yǎng)三種方式。目前，植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)主要采用懸浮培養(yǎng)方式，這主要是由于懸浮培養(yǎng)可以增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，促進營養(yǎng)的吸收；可帶走培養(yǎng)物產生的有害代謝產物，避免高濃度積聚對細胞的傷害；可保證良好的混合狀態(tài)，從而獲得良好的氣體傳遞效果；可以借鑒發(fā)酵工程的成熟技術，容易放大實現規(guī)?；?。 固定化細胞培 養(yǎng) 是在微生物和酶的固定化培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的。是固體培養(yǎng)的一種，但不是使用固體培養(yǎng)基，而是與固定化酶或固定化微生物細胞培養(yǎng)類似的一種植物細胞培養(yǎng)技術，目前應用最廣泛的、能很好保持細胞活性的固定化方法是將細胞包埋于海藻酸鹽或卡拉膠中。具體培養(yǎng)方法將在下一節(jié)中介紹。 （一）植物細胞培養(yǎng)基 對植物細胞的生長而言，培養(yǎng)基的組成成分是一個決定性的因素。植物細胞培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)相比，其最大的優(yōu)點是植物細胞能在簡單的合成培養(yǎng)基上生長。其培養(yǎng)基主要由無機鹽類、碳源、維生素、植物生長激素、有機氮源、有機酸等組成。 1．無 機鹽類 第 11 頁 共 22 頁 對于不同的培養(yǎng)對象和形式，無機鹽的最佳濃度是不相同的。通常在培養(yǎng)基中至少含有25mmol/L的硝酸鹽和鉀。雖然硝酸鹽可以單獨作為無機氮源，但是加人一點銨鹽對細胞生長有利。如果銨鹽單獨作為氮源，添加一些琥珀酸或其他三羧酸循環(huán)酸效果更好。對常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)和細胞懸浮培養(yǎng)來說，硝酸鹽加上銨的濃度可達到 60mmol/L，說明銨可能對某些培養(yǎng)物有重要作用。鎂、鈣和硫元素的濃度在ｌ～３ mmol／Ｌ范圍較為合適。所需的鈉、磷和氯化物有鈣鹽、磷酸鹽和微量營養(yǎng)物提供。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。 2．碳 源和能源 蔗糖或葡萄糖是常規(guī)的碳源，而果糖的利用效果較差。其他糖類均不合適作為單一的碳源。培養(yǎng)基中蔗糖被迅速分解為葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。大多數植物細胞對蔗糖的需求范圍是 2%到 4%。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量，可增加培養(yǎng)細胞的次生代謝產物量。 3．植物生長激素 植物激素是培養(yǎng)基中不可缺少的組成部分，大多數植物細胞培養(yǎng)基中都含有天然的和合成的植物生長激素。通常激素可分為二類：生長素和細胞分裂素。生長素能促進細胞分裂，常用的有吲哚乙酸（ IAA）、吲哚丁酸（ IBA）、 2， 4二氯苯氧基乙酸 （ 2， 4Ｄ）和萘乙酸（ NAA）。前兩種不穩(wěn)定，能被細胞釋放的酶降解，而后兩種被細胞降解的較慢，對熱穩(wěn)定。細胞分裂素常用的是 6芐基瞟憐（ 6BA），激動素（ kt）和玉米素（ zeatin）。將分裂素和生長素一起使用，效果更佳。使用量在 ~10ｍｇ／Ｌ之間，可根據不同細胞株而異。 4．維生素 在各種維生素中，硫胺素（維生素 B2）可能是必需的，而煙酸和吡哆辛（維生素 B6）對生長有促進作用。一般在培養(yǎng)基中都加了較多的肌醇，它能促進愈傷組織的生長。 5．有機氮源 通常采用的有機氮源 有水解酪蛋白 、谷氨酰 胺或氨基酸 混合物。 在 細胞初級培養(yǎng)的早期生長階段 ，有機氮源可促進胚胎發(fā)生和多胚性出現 。 6．有機酸 在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，加人丙酮酸或者三羧酸循環(huán)中間產物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸等，能夠保證植物細胞生長，并且耐受鉀鹽的能力也有所提高。 （二）植物細胞培養(yǎng)基的制備 配制培養(yǎng)基所用的蒸餾水最好是用玻璃容器蒸餾過的去礦質鹽的蒸餾水，所用的無機鹽、碳源、維生素應該采用高純度級的藥品。生長激素在使用前需要重結晶提純，其酒精－水溶液要用吸附法脫色處理。蛋白水解液最好用酶水解。對于吲哚乙酸、吲哚丁酸、 2， 4二氯苯氧基 乙酸和萘乙酸這樣難溶于水的生長激素類物質，配溶液時可先溶于 95%的酒精中，然后慢慢加人蒸餾水，稍微加熱，稀釋至所需體積，再調節(jié) pＨ。由于培養(yǎng)基配比中有些組分量很小，可按培養(yǎng)基配方濃度配成使用濃度的 10倍或者更多倍的母液，分成小瓶后冷凍保存，使用時再稀釋到正常濃度。為了防止在高濃度下培養(yǎng)基組分間相互作用產生沉淀，鈣鹽、鈉鐵鹽等要單獨配制保存，使用時再稀釋混合。維生素每種也是分開配制的。配制細胞分裂素物質，應先用少量濃度為 1mol/L的鹽酸來溶解，然后加蒸餾水至所需量。在培養(yǎng)基配制過程中可用 ，固體培養(yǎng)基加人瓊脂 %～％， 121℃蒸汽滅菌 15~20min。大多數培養(yǎng)基成分都經得起高溫滅菌，對于一些熱敏性化合物，如Ｌ谷氨酰胺、植物生長激素等應該用過濾法滅菌，然后再按無菌操作加人到己滅茵的培養(yǎng)基中。 二、植物細胞培養(yǎng)生物反應器 第 12 頁 共 22 頁 與天然栽培法相比，利用植物細胞培養(yǎng)技術生產藥用代謝產物、食品添加劑、化妝品等具有明顯的優(yōu)勢，但能成功地把搖瓶培養(yǎng)的結果放大到生物反應器中而實現大規(guī)模培養(yǎng)的較少，可見研究合適的生物反應器對于植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產有用代 謝產物是非常重要的。植物細胞培養(yǎng)反應器最初大多采用微生物反應器。由于植物細胞與微生物細胞形態(tài)結構不同，植物細胞較微生物細胞大，對氧需求小，對剪切力卻很敏感，因此不象微生物培養(yǎng)那樣采用高剪切的攪拌，而混合顯得更重要。目前，由于植物細胞懸浮技術的發(fā)展，單細胞培養(yǎng)的成功，加上各種新型生物反應器的問世，使得植物細胞有可能像微生物那樣在發(fā)酵罐中大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)。用于植物細胞培養(yǎng)的反應器主要有攪拌式、非攪拌式及其它新型生物反應器，另外還有植物細胞固定化反應器和膜反應器等。 （一）機械攪拌式生物反應器 機械攪拌式生物反應器 混合程度高，適應性廣，能獲得很高的溶氧系數 KLa，在大規(guī)模生產中廣泛使用。但是攪拌罐中產生的剪切力大，容易損傷細胞，且植物細胞培養(yǎng)一般只需較低的溶氧系數。因而對于有些對剪切力敏感的細胞，傳統(tǒng)的機械攪拌罐并不適用。為此，對攪拌罐進行了改進，包括改變攪拌形式、葉輪結構與類型、空氣分布器等，力求減少產生的剪切力，同時滿足供氧與混合的要求。 Kaman 等采用帶有 1 個雙螺旋帶狀葉輪(helicalribbonimpeller)和 3 個表面擋板的攪拌罐，證明適于剪切力敏感的高密度細胞培養(yǎng)。Jolicoeur 等進行了類似的研 究，在反應器中得到與搖瓶相同的高濃度生物量。鐘建江等通過培養(yǎng)紫蘇細胞進行比較，發(fā)現帶以微孔金屬絲網作為空氣分布器的三葉螺旋槳反應器 (MRP)能提供較小的剪切力和良好的供氧及混合狀態(tài)，優(yōu)于六平葉渦輪槳反應器，并認為在高濃度細 胞 培 養(yǎng) 時 ， MRP 型 反 應 器 將 顯 示 更 大 的 優(yōu) 越 性 。 離 心 式 葉 輪 反 應 器(centrifugalimpellerbioreactor)與細胞升式反應器 (cellliftbioreactor)相比具有較高升液能力，較低剪切力，較短混合時間，在高濃度下具有高得多的溶解氧系數，表明有用于剪切力敏感的生 物系統(tǒng)的巨大潛力。另有方框型槳式攪拌、蝶型渦輪攪拌等不同形式的機械攪拌罐用于植物細胞培養(yǎng)的生產和研究，結果證明不同葉輪產生剪切力大小順序為渦輪狀葉輪 平葉輪 螺旋狀葉輪。一種升流式生物反應器 (lifts