【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 檢測(cè)器 : UV280 nm ?進(jìn)樣體積 : 10 uL ?峰 1. glutamate dehydrogenase 2. lactate dehydrogenase 3. enolase 4. adenylate kinase 5. cytochrome C 使用反相模式對(duì)分離進(jìn)行優(yōu)化 HPLC方法的開(kāi)發(fā) 分離效果的改善 相鄰兩峰完全分離其分離度 Rs. 完全分離時(shí)的分離度 Rs = Rs = 峰形不是三角形 而是高斯分布 . 峰面積重疊率 峰重疊百分率是分離度和峰面積比的函數(shù) 峰面積比 Rs 1:1 1:3 1:10 1:30 1:100 % % (*)% (*)% (*)% (*) (*) 小峰僅僅以肩峰出現(xiàn) 分離度 , Rs N : N1和 N2的平均值 k‘ : k’1和 k39。2的平均值 ? ?R N kk=??????????????1 411aa39。39。 是 選擇性 柱效 容量因子 的函數(shù) 容量因子 , k’ t1 = 溶劑峰的保留時(shí)間 t0 = 溶劑峰的柱死時(shí)間 (非保留時(shí)間 ) t0 t1 k’ = t0 t1 t0 理論塔板數(shù) , N 方程 : N = 16 x ( Rt / W )2 實(shí)際修飾方程 : N = x ( Rt / W 1/2 )2 綜合修飾方程 : N = x (Rt x H / Area)2 W W1/2 H1/2 H Rt Area 分離因子 a 分離因子是兩個(gè)峰分離度的一個(gè)體現(xiàn) t0 t1 t2 a = k’2 k’1 t2 t0 t1 t0 = 選擇因子對(duì)分離度的貢獻(xiàn) a ( a 1/ a ) c ontr i buti on1 0/ 1 002 1/ 2 003 2/ 3 6710 10 / 11 0913 12 / 13 2317 16 / 17 4120 19 / 20 0 50100 99 / 10 0 90? ?R N kk= ???? ??? ???? ???1 4 1 1a a 39。39。 柱效對(duì)分離度的貢獻(xiàn) ? (N )1/ 2con tribu tion8000 89 10000 100 12%15000 122 37%20220 141 58%30000 173 94%? ?R N kk= ???? ??? ???? ???1 4 1 1a a 39。39。 容量因子對(duì)分離度的貢獻(xiàn) ? ?R N kk= ???? ??? ???? ???1 4 1 1a a 39。39。k39。 ( k 39。 / k 39。 + 1) c on t r i b u t i on1 1/ 2 2 2/ 3 3 3/ 4 4 4/ 5 10 10/ 11 20 20/ 21 50 50/ 51 100 100/ 101 影響分離度的因素 怎樣提高 N 第一步 ? HETP = 柱長(zhǎng) / N 范 德米特方程 HETP 線(xiàn)速率 最佳流速 每個(gè)柱子都有最佳流速 HETP (或 N) 和 流速 ?要獲得好的柱效 , mmID mL/min mmID mL/min mmID mL/min 以上設(shè)置是最佳的 . 增加柱子數(shù)目 1 2 3 4 5 6 7 8 柱子數(shù)量 雖然增加柱子數(shù)量能提高 N, 但是分離度僅僅能增加 40％ . 同時(shí)柱壓會(huì)劇烈增加 . 增加柱子數(shù)量并不實(shí)用 mmID mL/min mmID mL/min mmID mL/min N Flow rate 3 mm 10 mm 5 mm 降低填料粒徑并且選擇每根柱子的最佳流速 . 如果改變了粒徑 , 必須使用相同的填充物 . 否則會(huì)改變選擇性 怎樣提高 N 第二步 降低有機(jī)溶劑的比例 . 盡量使 k’= 1 – 10， 最好使 k’= 2 – 10， k’值小于 2，分離度不夠 k’值大于 10，會(huì)擴(kuò)展運(yùn)行時(shí)間 峰加寬 (1) 靈敏度變小 (2) 定量準(zhǔn)確性變差 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 k’ Rs 1 20 2 10 怎樣改善 k’ 甲醇 / 乙腈 / THF 1) 與水易于混和 2) UV 可以透過(guò) 3) 低粘度 4) 極性有差異 與甲醇相比，乙腈有以下優(yōu)點(diǎn) 1) 操作壓力更低 2) 洗脫能力稍高 3) 在低波長(zhǎng)范圍內(nèi)可以應(yīng)用 (185205nm) 選擇乙腈更好 . 然而 , 由于價(jià)格因素和 ANC的毒性，甲醇仍然是首選 溶劑的選擇 溶劑最優(yōu)化 甲醇 /水混合物做流動(dòng)相 樣品組成 : 硝基苯 , 苯 , 2,6二硝基甲苯 2硝基甲苯 , 4硝基甲苯 , 3硝基甲苯 ,甲苯 , 2硝基 1,3二甲苯 4硝基 1,3二甲苯 , m二甲苯 100% MeOH K’ 80% MeOH K’ 溶劑最優(yōu)化 ODS 柱 樣品組分 Peak 1: nitorbenzene Peak 2: benzene Peak 3: 2,6dinitrotoluene Peak 4: 2nitrotoluene Peak 5: 4nitrotoluene Peak 6: 3nitrotoluene Peak 7: toluene Peak 8: 2nitro1,3xylene Peak 9: 4nitro1,3xylene Peak 10: mxylene 60% MeOH K’ 55% MeOH 1K’20 k’和有機(jī)溶劑百分率 (B%)間的關(guān)系 ?log(k’) = a(B%) + b (a, b 系數(shù) ) 對(duì)于小分子 , a 有機(jī)溶劑每增加 10% (B%) ， 每個(gè)波段的 k’ d大約降低 3. log(k’) (B%) Peak 3 Peak 2 Peak 1 分離度圖 如果可以事前預(yù)測(cè)保留時(shí)間 , 就可以計(jì)算出分離度 (Rs). 通過(guò)左邊的有機(jī)溶劑濃度與分離度之間的關(guān)系示意圖，可以對(duì)有機(jī)溶劑的濃度進(jìn)行最優(yōu)化 怎樣改善 a ?改變 ?有機(jī)溶劑類(lèi)型 ?pH ?緩沖液濃度 ?柱溫 ?柱類(lèi)型（ C8, 氰基和苯基） ?柱基質(zhì) ?流動(dòng)相中加入其他有機(jī)溶劑 a 和溶劑類(lèi)型之間的關(guān)系 ?由于選擇性 (a)不能被準(zhǔn)確預(yù)測(cè) , 因此選擇合適的溶劑組成是比較浪費(fèi)時(shí)間的 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ACN / H2O MeOH / H2O THF / H2O [ 溶劑極性和溶劑類(lèi)型的關(guān)系 ] 改變?nèi)軇╊?lèi)型 ? 雖然使用某一種有機(jī)溶劑不能得到好的分離度 , 但只要它們之間的關(guān)鍵峰對(duì)不一樣，幾種有機(jī)溶劑的組合卻可能有好的分離度 a b c d a b c d [ MeOH/H2O ] 注意 : c,d [ THF/H2O ] 注意 : a,b a b c d [ MeOH/THF/H2O ] 離子強(qiáng)度和 pH ? 對(duì)于含有酸性和堿性化合物的樣品 , 保留時(shí)間隨著離子強(qiáng)度和 pH的變化而變化 ? 為了獲得好的重現(xiàn)性，選擇合適 PH值的緩沖液濃度是非常重要的 ? 選擇合適的緩沖液 RCOO 和 RNH3+ k’和 pH之間的關(guān)系 ? 在反相色譜中， k’ 和 pH之間的關(guān)系不是線(xiàn)性的或者是二次方程的，流動(dòng)相的 PH值對(duì) 有機(jī)酸和胺的 k’ 值有影響 . pH 流動(dòng)相 ) pKa k’ 非解離狀態(tài) 解離狀態(tài) 只有在 pKa+/ , 才會(huì)顯示 k’ 和 pH 的線(xiàn)性關(guān)系 RCOOH RCOO + H+ (pKa=) RNH3+ RNH2 + H+ (pKa=) 流動(dòng)相 pH值對(duì)化合物分離的影響 1:苯甲酸 2:山梨酸 3:對(duì)羥基苯甲酸甲酯 [分析條件 ] 1mL/min ODS 柱 10mM 磷酸鹽緩沖液 75% 乙腈 25% 40oC UV240 nm 樣品 pKa值是分子結(jié)構(gòu)的函數(shù) 官能團(tuán) pKa (Acids) pKa(Bases) aliphatic sufoxide 噻唑 1 3 芳香胺 4 7 (苯胺 , 嘧啶 ) 氨基酸 2 4 9 12 羧酸 3 5 bhydroxy aliphatic amines 6 8 aromatic thiols 10 11 phenols 10 11 aliphatic amines 9 11 carbazoles 10 12 調(diào)整 pH值的注意點(diǎn) ? 當(dāng)流動(dòng)相的 pH值與目標(biāo)樣品的 pKa值 非常接近時(shí) , 應(yīng)該仔細(xì)調(diào)整 pH 值 , 因?yàn)榱鲃?dòng)相的 pH 值對(duì) k’有影響 . ? 一般 , 應(yīng)該選擇對(duì) k’沒(méi)有影響的 pH. pH (流動(dòng)相 ) k’ 非解離狀態(tài) 解離狀態(tài) k’和緩沖液離子強(qiáng)度的關(guān)系 ? log(k’) 和 流動(dòng)相緩沖離子強(qiáng)度之間的關(guān)系如下 log(k’) = a(mM) 2 + b(mM) + g ? 一般不使用濃度高于 100 mM的緩沖液 .因?yàn)楦邼舛鹊木彌_液會(huì)對(duì) LC的硬件造成麻煩，如降低柱塞桿密封圈的壽命、堵塞管路造成壓力升高等 . ? 10 20 mM (pH 3 4) 的緩沖液是最常用的 離子強(qiáng)度對(duì) PTH 衍生物的保留特性的影響 H: 組氨酸 R: 精氨酸 苯基柱 [梯度 ] 15min內(nèi) ,甲醇 %%, THF %%, 磷酸鹽緩沖液 () %61%， 保持最終濃度 15min (a) 12 mM 緩沖鹽 (b) 8 mM 緩沖鹽 (c) 4mM 緩沖鹽 緩沖液 pH值和 pKa值之間的關(guān)系 AH A + H+ log(K) = log ([ A ][ H+] / [ AH ]) = log ([ A ] / [ AH ]) + log ([ H+]) pH = pKa + log ([ A ] / [ AH ]) K = [ A ] [ H+] / [ AH ] 有機(jī)酸緩沖液的 pKa值 conc. pKa1 pKa2 conc. pKa conc. pKa1 pKa2 pKa3 100 100 100 90 90 90 80 80 80 70 70 70 60 60 60 50 50 50 40 40 40 30 30 30 20 20 20 10 10 10 磷酸鹽緩沖液 醋酸鹽緩沖液 檸檬酸鹽緩沖