植物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-28 02:17 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 尖 1）酶混合液 配制分兩部進(jìn)行： （ 1）將 7 mmol/L MES 3 mmol/L 甘露醇 mmol/L 用重蒸餾水溶解，調(diào) ，定容為酶儲(chǔ)備液，滅菌備用。 （ 2）使用時(shí)再加入： 纖維素酶 R10 % 果膠酶 R10 1% 因酶制劑經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理后會(huì)失活，故先將酶儲(chǔ)液滅菌，待用時(shí)再將酶制劑按比例加入到第一步已滅菌的酶液內(nèi)。 2）配制 （ 用于懸浮原生質(zhì)體） 3)PEG液： 30%（ w/v) PEG(MW=6000) kH2PO4 山梨醇 mol/L 調(diào) pH ；用時(shí)現(xiàn)配！ 4）電融合液： 甘露醇 pH ~ 1）大型儀器： 高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，倒置顯微鏡，電融合儀。 2）一般實(shí)驗(yàn)用品 大小培養(yǎng)皿，小燒杯，小滴管，刻度離心管，小漏斗，不銹鋼網(wǎng) 300目 五 .實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)路線： 煙草葉肉及洋蔥根尖原生質(zhì)體酶解分離 提純?cè)|(zhì)體并調(diào)整原生質(zhì)體密度 ，電擊使原生質(zhì)體融合 倒置顯微鏡觀察并照相 實(shí)驗(yàn)步驟： 10ml，分別加入纖維素酶和果膠酶,，制備酶液。 ：煙草、洋蔥根尖各 取洋蔥根尖，并將其切成 平皿中；取煙草葉片將其剪成 大小放入小平皿中。 ：將酶液等量加入到存有實(shí)驗(yàn)材料的平皿中，放入 250c培養(yǎng)箱酶解。洋蔥約 4h，煙草約3h。 1）酶解后，用 300目銅網(wǎng)過(guò)濾酶液，去除未酶解的雜質(zhì)，將濾液收集在 10ml離心管中。 2） 1000轉(zhuǎn) /分離心 3分鐘，用吸管或移液槍棄上清（注意不要把收集的原生質(zhì)體吸走）。 3）用 （約 1ml）懸浮下面的原生質(zhì)體（ PEG法）；電融合法則用電融合液懸浮。 4）顯微鏡觀察提純后的原生質(zhì)體，若雜質(zhì)較多可重復(fù) 1）～ 3）操作。 純化的原生質(zhì)體圖示 完整洋蔥原生質(zhì)體（ 40 ） 完整煙草原生質(zhì)體（ 40 ） 用血細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)。每一樣品測(cè)定 3次，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，將懸浮原生質(zhì)體密度調(diào)整至5*105個(gè) /ml。 （一） PEG法 1）配制 PEG液（ 5ml） 30%（ w/v) PEG(MW=6000)
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