基因的體外重組和轉(zhuǎn)化(編輯修改稿)
2025-05-26 05:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 酶切產(chǎn)生 3‘末端未配對的 T； ? 應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶與雙脫氧 TTP加入一個(gè)突出的 T殘基到線形化載體的 3’末端。 ? 應(yīng)用不依賴末端的 Taq DNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性在線形化載體的 3‘末端出的羥基基團(tuán)上催化連接上一個(gè) T堿基。 五、 Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng) Gateway技術(shù)： 一種克隆操作平臺：把目的基因克隆到入門載體（ Entry Vector）后，就不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點(diǎn)和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（ Destination Vector，目的載體）上。 Gateway技術(shù)的靈活性： ? 整合后的附著位點(diǎn)為 attL（ BOP’） attR（ POB’） ? 整合位點(diǎn) attB attP 切除位點(diǎn) attL attR ? 整合過程需要介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。 第二節(jié)、重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞 ? 轉(zhuǎn)化 (transformation):受體細(xì)胞捕獲并表達(dá)質(zhì)粒 DNA的生命過程； ? 轉(zhuǎn)染 (transfection):受體細(xì)胞捕獲并表達(dá)噬菌體 DNA的生命過程； ? 轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction):重組體包裝成噬菌體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。 重組體的轉(zhuǎn)化 受體細(xì)胞 重組體的轉(zhuǎn)化 受體細(xì)胞的選擇 （ 1）具有接受外源 DNA的能力； （ 2）限制酶缺陷型； （ 3） DNA重組缺陷型； （ 4）不適于在人體內(nèi)或非培養(yǎng)條件下生存； （ 5）它的 DNA不易轉(zhuǎn)移。 一、大腸桿菌感受態(tài)的制備 感受態(tài)： 細(xì)胞處于能攝入核酸分子時(shí)的生理狀態(tài)就稱為感受態(tài)。 1970年 Mandel和 Higa發(fā)現(xiàn)用 CaCl2處理過的大腸桿菌能夠吸收噬菌體 DNA。此后不久， Cohen等人用 CaCl2法實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，操作原理如下： ?將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌置入 0℃ 的 CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，再加入 DNA， Ca2+與 DNA結(jié)合形成抗 DNase的羥基 磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上；經(jīng)短暫的42℃ 熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加， DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 CaCl2處理 受體細(xì)菌 CaCl2
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