國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)豬多能干細(xì)胞技術(shù)規(guī)范(編輯修改稿)
2025-05-15 04:47 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的特點(diǎn)將對(duì)轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)有極大的推動(dòng)。下表對(duì)已經(jīng)報(bào)道的人類(lèi)疾病模型轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行匯總[]。）異種器官移植及器官再生研究異種器官移植對(duì)于緩解人類(lèi)器官移植的供求關(guān)系失衡來(lái)說(shuō)前景巨大。豬的器官大小及發(fā)育周期同人類(lèi)十分相似，是良好的器官提供供體，但是除了異種的免疫排異反應(yīng)需要解決外，豬本身所帶的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（）也是臨床轉(zhuǎn)化的一大障礙。劍橋大學(xué)等利用技術(shù)敲除了全部并且通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得了無(wú)的克隆豬[]，這證明了在全基因組被敲除的可能性，為異種器官移植的臨床應(yīng)用提供了安全保障。豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展自年首次報(bào)道誘導(dǎo)多能干細(xì)胞后，技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注。用病毒載體將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（, , 和）的組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程而得到的類(lèi)似胚胎干細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞。技術(shù)是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，它回避了歷來(lái)已久的倫理爭(zhēng)議，解決了干細(xì)胞移植醫(yī)學(xué)上的免疫排斥問(wèn)題，使干細(xì)胞向臨床應(yīng)用又邁進(jìn)了一大步。 技術(shù)的產(chǎn)生同時(shí)也給豬、牛和羊等大動(dòng)物多能性干細(xì)胞的建立帶來(lái)了新希望。人們希望 可以成為豬胚胎干細(xì)胞的可替代材料, 應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)。自年，成功建系以來(lái)[。 ]，究者除了采用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的誘導(dǎo)方法, 還采用了轉(zhuǎn)座子、 質(zhì)粒以及 模擬體等多種方法誘導(dǎo) []。誘導(dǎo) 的培養(yǎng)體系主要參照小鼠和人的 的培養(yǎng)體系。使用不同的培養(yǎng)體系 會(huì)呈現(xiàn)不同的細(xì)胞形態(tài)。但是，目前只有 等報(bào)道的, 注射到豬囊胚中可以獲得嵌合體豬，但是僅用 方法對(duì)生殖系嵌合的豬進(jìn)行鑒定, 缺乏更有利的證據(jù)[]。 等報(bào)道 239。 的 可以嵌合到早期豬胎體中, 卻無(wú)法獲得成活的后代[]。這些結(jié)果表明目前建立的 還沒(méi)有達(dá)到真正的 239。 狀態(tài) 。七、關(guān)鍵試驗(yàn)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)說(shuō)明豬多能干細(xì)胞建系方法 豬細(xì)胞建系的細(xì)胞來(lái)源 目前，用于豬胚胎干細(xì)胞建系的源頭細(xì)胞目前主要是囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞（ ，）,目前報(bào)道的能夠長(zhǎng)期傳代的豬的類(lèi)胚胎干細(xì)胞細(xì)胞系均來(lái)源于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。此外，細(xì)胞期胚胎[]、桑葚胚[]或附植前胚胎[]也可作為源頭細(xì)胞用于分離培養(yǎng)豬胚胎干細(xì)胞，但由細(xì)胞胚胎或桑葚胚用于建系時(shí)，胚胎貼壁率低，形成率低，均未獲得能夠穩(wěn)定傳代的豬的多能干細(xì)胞系。豬胚胎干細(xì)胞建系所用的胚胎主要來(lái)源于沖取的體內(nèi)正常胚胎和核移植胚胎、孤雌胚胎、體外受精胚胎等體外培養(yǎng)獲得的囊胚。 胚胎接種方式胚胎干細(xì)胞建系過(guò)程中胚胎接種形式包括機(jī)械分割法，酶消化法、免疫外科法以及全胚接種法。機(jī)械分割法：用玻璃管拉成細(xì)針或用普通的 注射器在顯微鏡下機(jī)械分離細(xì)胞，將細(xì)胞接種培養(yǎng)。 這是一種高效，經(jīng)濟(jì)，省時(shí)且無(wú)污染的理想方法，需要操作者操作熟練技術(shù)穩(wěn)定。酶消化法：鏈蛋白酶或機(jī)械法去除胚胎透明帶后，將其置于的胰蛋白酶細(xì)胞消化液中消化，在顯微鏡下將滋養(yǎng)層細(xì)胞開(kāi)始脫落的囊胚移入培養(yǎng)液中，用口吸管和玻璃針?lè)蛛x,接種培養(yǎng)。免疫外科法：用的鏈蛋白酶處理胚胎分鐘，使囊胚脫掉透明帶，將脫去透明帶的囊胚置于抗體中，然后轉(zhuǎn)入補(bǔ)體中，利用抗體和補(bǔ)體相互作用使囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生免疫溶解，出去溶解的滋養(yǎng)層細(xì)胞，從而得到 細(xì)胞。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)。全胚接種法：豬囊胚的 很小且不明顯，這樣就給免疫外科法和機(jī)械分離法帶來(lái)困難。因此，可以將經(jīng)過(guò)自然孵化或酶解法脫掉透明帶的胚胎直接接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，通過(guò)反復(fù)傳代去除 細(xì)胞和已分化的細(xì)胞，就可以分離到豬胚胎干細(xì)胞，這種方法的操作簡(jiǎn)單，但是由于未去除 細(xì)胞，需要經(jīng)過(guò)多次的傳代純化才能建系，建系效率較低。豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞建系方法豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建系方法主要參考 等文獻(xiàn)中報(bào)道的方法[]。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝⑴ 細(xì)胞的培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天保證細(xì)胞密度在 , 分布均勻狀態(tài)健康。⑵ 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 細(xì)胞。①在 離心管中加入 μ , 按照質(zhì)粒與脂質(zhì)體 ( μ: μ)的比例加入 ,輕輕混勻。室溫靜置 。②在另一個(gè) 離心管中加入 μ , 加入 過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒(μ)與包裝質(zhì)粒 ( μ), 輕輕混勻。室溫靜置 。③ 將上述兩個(gè) 離心管中的液體混勻, 使脂質(zhì)體與質(zhì)粒形成絡(luò)合物。室溫靜置 。④ 棄去 培養(yǎng)瓶中舊的細(xì)胞培養(yǎng)基。加入 培養(yǎng)基, 然后逐滴加入脂質(zhì)體與質(zhì)粒的混合物。將 培養(yǎng)瓶輕輕地放回培養(yǎng)箱中。⑤ 轉(zhuǎn)染 后, 在二級(jí)安全柜內(nèi)將 更換為含有血清的 培養(yǎng)基。逆轉(zhuǎn)錄病毒收集以及濃縮⑴ 在二級(jí)生物安全柜進(jìn)行以下操作。病毒包裝后的 , 開(kāi)始收集 細(xì)胞上清液, ℃, 離心 , 去除大塊細(xì)胞碎片。⑵ 使用 μ 濾膜過(guò)濾上清液至超速離心管中, 進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片。⑶ 在分子天平上配平超速離心管。⑷ 超速離心濃縮病毒。使用 轉(zhuǎn)子, ℃, 速度離心 。⑸ 超速離心后, 輕輕取出離心管, 拿到二級(jí)生物安全柜內(nèi)打開(kāi)?？梢钥吹皆陔x心管底有淡黃色沉淀, 用標(biāo)記筆圈住。倒掉上清, 用 移液器吸掉殘余的病毒上清。再用新鮮培養(yǎng)基溶解沉淀,吸到 離心管中。濃縮的病毒放在 ℃暫存。⑹ 所有實(shí)驗(yàn)垃圾用 次氯酸鈉溶液浸泡處理。感染成纖維細(xì)胞⑴ 病毒感染的前一天準(zhǔn)備豬胎兒成纖維細(xì)胞。⑵ 第二天觀察細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1