【文章內容簡介】 Bm1433ζ的表達量在各個組織及時期均比Bm1433ε高；兩種1433蛋白在絲腺中都有大量表達。通過Western blotting和免疫熒光法分析了兩種1433蛋白的亞細胞定位，Bm1433ζ蛋白既存在于細胞質中也存在細胞核中，而Bm1433ε蛋白主要位于細胞質中。這些說明Bm1433ζ可能是組成性表達，而Bm1433ε的表達具有時期和組織特異性，且兩種1433蛋白可能對絲腺的基因表調控以及絲蛋白的形成具有重要作用。我們同時研究了Bm1433ζ在蛹、絲腺、頭部、脂肪體以及腸中的結合蛋白，電泳分析發(fā)現(xiàn)在每一個組織中可與Bm1433ζ蛋白結合的蛋白至少有4個組分，這些組分的大小主要位于28~54 kDa之間，Bm1433ζ在各組織的結合蛋白大小非常相似，這說明Bm1433ζ在細胞的各項生命活動中起著關鍵作用。相關研究成果發(fā)表在BBA上。（d）家蠶肌鈣蛋白C基因的研究肌鈣蛋白C（Troponin C, TnC）是一種EF手圖形超家族蛋白，可以結合Ca2+并發(fā)揮其生物學功能。目前，國內外對肌鈣蛋白C的研究多數(shù)集中在脊椎動物上，而對無脊椎動物的研究較少。我們獲得并表達了家蠶TnC基因，制備的相應抗體效價可達到1：25600以上。Western blotting表明，BmTnC蛋白在家蠶的表皮、腸道、頭、馬氏管、睪丸等組織中都有表達，且表達量依次降低，而在絲腺和脂肪體中我們并沒有檢測到該蛋白的存在。通過免疫組織化學實驗，我們也發(fā)現(xiàn)該蛋白主要分布在家蠶五齡幼蟲的表皮、氣門、腸道、馬氏管、頭部等組織中，以及蛹的頭部、腸道、體壁等組織中。亞細胞定位結果表明，該蛋白主要存在細胞質中。我們還利用熒光定量PCR的方法，對家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾等發(fā)育時期，以及五齡幼蟲各組織中的靶mRNA的量進行比較。用Protein A凝膠柱純化多克隆抗體，并將純化所得的抗體用于制作免疫親和柱，從家蠶中純化天然的BmTnC，為研究該天然蛋白的功能活性打下基礎。相關研究成果發(fā)表在Cell Tissue 。（e）家蠶前纖維蛋白表達分析及其特征前纖維蛋白（profilin）是一種低分子量肌動蛋白結合蛋白，其在一些細胞過程中如膜轉運、小的GTPase信號途徑、核內活性及神經(jīng)發(fā)生及分化和腫瘤形成中起重要作用，同時可能通過特異的方式連接到不同的信號通路。我們獲得并表達了家蠶profilin基因BmPFN，制備的多克隆抗體效價為1:32000。亞細胞定位研究表明BmPFN主要分布于細胞質中。熒光定量PCR結果顯示BmPFN蛋白在各組織中絲腺表達量最高，生殖器表達量次之，脂肪體中的表達量最低；在卵、幼蟲、蛹和蛾四個發(fā)育時期中，幼蟲的表達量最高，蛹次之，蛾中較少，卵中表達量最少；同時Western blotting結果顯示BmPFN在蛹期表達最高，mRNA轉錄水平和蛋白表達水平存在一定的差異，該蛋白可能存在翻譯水平的調控，如microRNA對蛋白表達調控，生物信息學分析也表明該基因mRNA存在9個microRNA結合位點，正在進行進一步的試驗驗證。RNA干擾實驗顯示BmPFN在家蠶細胞正常的增殖中起重要作用。相關研究成果發(fā)表在Appl. Biochem. 。（f）家蠶AdoMet依賴的RNA甲基轉移酶基因的RNAi及亞細胞定位研究RNA甲基化是細胞內轉錄后加工過程的一種形式，存在于各種生物體內，與生物合成、信號轉導、蛋白修復、染色體調控及基因沉默等均有較大關系。RNA中的這些甲基化修飾主要是通過SadenosylLmethionone（AdoMet）依賴的甲基轉移酶(MTase)來催化的。我們獲得并表達了家蠶AdoMet依賴的RNA甲基轉移酶基因，制備的抗體效價為1：51200。Western印跡分析呈陽性并發(fā)現(xiàn)在蠶蛹中也有特異性條帶，分子量為20kD左右，證實了重組蛋白的表達。免疫熒光細胞定位實驗結果表明，RNA MTase大量存在于細胞質中，同時細胞核中也有RNA MTase存在，但量相對較少。我們還合成了BmRNAMTase的dsRNA，并轉染了家蠶細胞Bm5，通過MTT法測細胞活性，實驗結果表明， μg/ml、干擾72h后細胞活性明顯降低。同時，在干擾72 h后，用ELISA方法檢測細胞中蛋白的表達量，結果表明，RNAi后細胞中的蛋白量明顯減少。DNA Ladder實驗表明，干擾后死細胞數(shù)量增加，但細胞并未發(fā)生正常的凋亡現(xiàn)象，推測是干擾后一些非正常因素導致了細胞的死亡。相關研究成果發(fā)表在Comp. Funct. 。（g）家蠶中一個新Kazal型蛋白酶抑制劑的表達、定位及其功能研究Kazal型蛋白酶抑制劑廣泛存在于生物體內，對機體的發(fā)育和免疫應答等生理過程發(fā)揮極其重要的作用。我們獲得并表達了家蠶Kazal型蛋白酶抑制劑基因，制備的抗體效價達到1:106000以上。將爬片的Bm5細胞進行細胞免疫實驗，發(fā)現(xiàn)BmSPI表達在細胞質中，而細胞核中幾乎沒有。取五齡家蠶做橫切冷凍切片，用Cy3標記的羊抗兔二抗做免疫組織定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白幾乎遍及各組織中，特別是表皮中含量最高。提取五齡蠶的各個組織和各個時期（卵，幼蟲，蛹，蛾）的總RNA，進一步用熒光相對定量PCR檢測表明BmSPI在表皮中表達量最高，脂肪體中表達量最低，在幼蟲期中表達量最高，在卵期表達量最低。將制備的雙鏈RNA經(jīng)脂質體轉染家蠶Bm5細胞，干擾后進行PI染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)干擾組與對照組的細胞沒有顯著差異，沒有引起細胞凋亡。相關研究成果發(fā)表在Comp. Biochem. 。(2) 家蠶蛋白質組學研究（a）家蠶蛋白質組技術平臺的優(yōu)化及有性與孤雌生殖的比較蛋白質組研究為了提高家蠶卵蛋白二維電泳分析效率，我們開發(fā)了一種新型的2DE樣品上樣方式。該上樣方式改進了傳統(tǒng)的上樣技術，采用八孔道加樣器和獨特的上樣程序減小了蛋白樣品的損失。2DE是目前蛋白質組研究中用來分離復雜蛋白體系的最重要的手段，2DE的技術流程包括電泳前的樣品制備上樣固相第一向電泳第二向電泳染色及圖譜分析等，其中上樣步驟對2DE的結果至關重要。現(xiàn)有的2DE的上樣方式主要有水化上樣（混合上樣）和杯上樣兩種。水化上樣方式極大的受到了上樣過程中蛋白質吸附現(xiàn)象的影響，導致樣品蛋白質損失達2555%；杯上樣的2DE圖譜結果通常優(yōu)于水化上樣，但耗時較長；而且水化后需人工將膠條轉移至等電聚焦裝置，容易帶進人為的誤差。我們改進的上樣方式通過采用八孔道加樣器，先將水化液轉移到膠條槽內，再將樣品以均勻滴加的方式分布在水化液滴上，在重漲膠條過程中施加電壓。改進的上樣方式減小了水化上樣2DE過程中蛋白質的丟失，有利于膠條對蛋白質的吸收。實驗結果表明，該方法電泳結果較常規(guī)的水化上樣有明顯的改善（952177。15 vs 586177。12）；同時，八孔道加樣器使用簡單和可確保實驗的重復性。通過考察這兩種上樣方法對蛋白質回收率的大小的影響，發(fā)現(xiàn)該上樣方式蛋白質回收率比水化上樣高出約20%，從而進一步確認了2DE電泳的結果。為了獲得更多的家蠶卵蛋白，我們開發(fā)了一種新的家蠶卵蛋白樣品制備方法。新的樣品制備方法采用兩步法抽提易溶性和難溶性樣品后，再將易溶性樣品以優(yōu)化比例加入到難溶性樣品，從而大大降低了易溶性高豐度蛋白的干擾。樣品的制備無疑是蛋白質組學2DE電泳分離最為重要和關鍵的一步。在對家蠶卵進行2DE分離時，我們注意到由于卵的一些高豐度蛋白質如卵黃磷蛋白質(Vtn )、卵特異蛋白(ESP)和30 KP 家族蛋白質在樣品中占據(jù)了相當?shù)谋壤瑢е铝嗽S多低豐度蛋白質很難被檢測。本研究工作成功建立的一種蠶卵蛋白質制備的新方法，通過采取獨特的預分離策略有效減少了蠶卵樣品中高豐度蛋白質含量，從而提高了低豐度蛋白質的上樣量。與傳統(tǒng)的“一步提取法”的比較顯示出，該方法大大提高圖譜蛋白點的檢出率；選取了部分獨有的蛋白質點進行了成功的基質輔助的激光解吸飛行時間質譜（MALDITOFTOF MS）鑒定和功能分類及分析，證實了該方法應用于研究對象的有效性和適用性。采用該制備方法獲得了據(jù)我們所知迄今為止分離蠶卵樣品最多點的蛋白質組圖譜，這將有利于更多生物相關蛋白的發(fā)現(xiàn)以及鑒定，為構建較完善的蠶卵蛋白質組數(shù)據(jù)庫和蛋白質組學方法學應用奠定了實驗基礎。相關研究成果發(fā)表在J. Chromatogr. A上。我們進行了家蠶有性生殖和孤雌生殖的比較蛋白質組學研究。為獲得家蠶有性生殖與孤雌生殖卵及蟻蠶樣品，我們采用浸酸處理獲得有性生殖樣品及Astaurov的溫湯處理作為孤雌誘導條件，并在前人研究基礎和本實驗室現(xiàn)有條件下對家蠶孤雌生殖孵化的一些處理條件做了實驗條件摸索。實驗結果表明高溫激變方法可獲取較滿意的無性繁殖發(fā)育卵和孵殖率；并且高溫刺激方法獲得的孵化率在一定時間范圍內隨著卵齡的增加孵化率有所提高。本研究因此獲得了足量樣品量以用于蛋白質組實驗研究目的。我們采取上述開發(fā)的蛋白質組學技術手段分析了家蠶有性和孤雌生殖蛋白質組表達的變化。通過2DE分離和電泳圖像分析、對差異點進行膠內酶解以及MALDI MS和MS/MS的鑒定，共有46個差異蛋白質得到了可信的確認。通過蛋白質組生物信息學的功能分析，發(fā)現(xiàn)一些重要相關蛋白質，涉及了細胞骨架蛋白，HSP蛋白家族以及與細胞周期，凋亡和信號轉導等相關蛋白質，這些差異表達的蛋白質可能通過不同途徑參與了家蠶孤雌生殖的發(fā)育過程并發(fā)揮著不同的功能。該工作為蠶孤雌生殖相關的關鍵蛋白質篩選及研究家孤雌生殖機制提供了豐富實驗數(shù)據(jù)和有用線索，對發(fā)現(xiàn)與開發(fā)候選的生物標記分子將有著重要的意義。（b）家蠶Yellow基因家族的鑒定和分析研究表明，Yellow蛋白家族在蜜蜂和果蠅的發(fā)育過程中呈現(xiàn)重要的生理和生化功能，該蛋白家族成員都包含一個MRJP保守域。目前為止，在鱗翅目昆蟲中還沒有該蛋白家族的報到。我們通過果蠅Yellow基因序列進行blast比對分析獲得家蠶Yellow基因的EST序列，然后通過RACE法得到家蠶Yellow蛋白家族成員全長cDNA序列，該蛋白家族包含存在MRJP域和信號肽的7個成員。遺傳進化分析表明，家蠶Yellow蛋白家族成員組成一個單獨的進化群，與果蠅和蜜蜂Yellow蛋白家族不在一個進化區(qū)。通過RTPCR，我們研究了家蠶Yellow蛋白家族基因的組織表達譜。家蠶Yellow蛋白家族至少包含7個成員，每個成員較低的同源性和獨特的表達模式預示家蠶Yellow蛋白家族可能在家蠶發(fā)育過程中發(fā)揮重要的生理功能。相關研究成果發(fā)表在BMC Genomics上。（c）家蠶的蛋白質組學鑒定與功能分析質譜是一種有效的大規(guī)模蛋白組學鑒定的有效工具。本研究中我們通過質譜鑒定了家蠶ORF庫和cDNA序列虛擬ORF庫。為了研究家蠶蛋白表達，我們首先構建了三個推測蛋白庫：第一個蛋白庫為從9180。家蠶基因組草圖預測得到的蛋白庫，共14,632 潛在蛋白；第二個蛋白庫為從我們構建的家蠶蛹cDNA文庫得到的蛋白庫，共4,074個30個aa以上的潛在蛋白；第三個蛋白庫為UniProt蛋白庫中下載的家蠶蛋白，共2111個蛋白。.通過質譜分析，我們共得到threshold分大于60%的肽序列共81,000 個，其中55,400個有效序列進行了蛋白庫比對分析。通過比對分析，上述構建的三個蛋白庫中分別有6649, 250和868個蛋白能夠和質譜序列進行匹配，%, %, 和43%。通過生物信息學進行功能分析表明，匹配的蛋白中有1517個蛋白存在預測的跨膜區(qū)；1165個蛋白存在信號肽。這些研究為家蠶蛋白的表達和功能分析打下基礎。相關研究成果擬發(fā)表在Proteomics上。(3) 家蠶RNA相關研究（a）家蠶microRNA的鑒定與功能研究microRNA(miRNA)是一類能調控基因表達的小分子RNA，目前為止，在家蠶中只有l(wèi)et7 通過Northern blotting得到驗證。我們通過基于序列的同源性搜索，結合基于生物芯片和Northern blotting試驗驗證方法在家蠶中首次鑒定 了46個miRNA，21個可能的miRNA和1個新的小RNA。鑒定出的新的小RNA命名為bmomiR100like ，它是以miRNA agamiR100為探針，采用生物芯片和Northern blotting鑒定出，但是其前體序列不能折疊為miRNA前體常見的發(fā)夾結構。在這些鑒定出的miRNA中，有12對miRNAs和miRNA*s。Northern blotting顯示某些家蠶miRNA只在家蠶某些特定的發(fā)育階段表達，揭示這些miRNA可能呈發(fā)育時序特異性表達（如bmomiR277）。我們在家蠶基因組中鑒定了2個miRNA基因族，其中，bmomiR2b屬于基因族bmomiR2a1/bmomiR2a1*/bmomiR2a2/bmomiR2b/bmomiR13a*/bmomiR13b, 其為mir2 基因家族的新成員。進一步，我們發(fā)現(xiàn)在Northern blotting中，用來檢測miRNA的DNA探針甲基化能夠提高探針檢測的靈敏度。根據(jù)功能保守性分析表明，家蠶中11個鑒定出的miRNA可能調控13個已知果蠅miRNA靶基因的同源基因。我們通過生物信息學方法預測了1671個家蠶基因mRNA的3’UTR中存在的miRNA結合位點，共發(fā)現(xiàn)547個基因存在986個miRNA結合位點。在這些靶位點中，338個能夠和43個miRNA種子區(qū)很好地配對。在預測的miRNA靶基因中，有61個基因存在多個靶位點，這61個預測的靶基因應該作為將來功能研究的首選基因。預測miRNA靶基因的生物學分類（GO分類）表明，binding, catalytic activity 和 physiological process為預測靶基因的主要功能關鍵詞。相關研究成果發(fā)表在BMC Genomics上。（b） 家蠶RNA編輯研究RNA編輯能夠通過改變某個特定的密碼子使得mRNA轉錄和蛋白表達呈現(xiàn)多樣性。A to I RNA編輯作為一種遺傳基因重編碼能夠改變蛋白序列高度保守的編碼區(qū)域。令人感興趣的是，一個物種及其近緣物種中存在A to I 編輯位點的位置在基因組上為固定的G。進化分析表明，DNA水平的G to A 突變可能被轉錄后修飾的A to I RNA編輯校正，編輯得到的I(G)可以以硬接