db21t18614-20xx水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程簡(jiǎn)單重復(fù)序列擴(kuò)增法(編輯修改稿)
2025-05-04 03:03 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 酶、蛋白酶K共400μL，用力碾磨30s。，65℃保溫15~60min，按GBT ，用苯酚和氯仿方法抽提DNA； (3mol/L，) 和兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀；溶于50181。L TE緩沖液 (10mmol/L TrisHCl pH ，lmmol/L EDTA)，置20℃保存?zhèn)溆谩?DNA產(chǎn)物測(cè)定 DNA純度檢測(cè)吸取1~3 181。L提取的DNA，用濃度1~2％瓊脂糖凝膠100V電泳 30 min，檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量。以DNA條帶的分子量及有無(wú)拖尾為標(biāo)準(zhǔn)判斷DNA的質(zhì)量。 DNA濃度檢測(cè)（1）紫外吸收定性測(cè)試分別于260 nm波長(zhǎng)和280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值。確定A260／~，方可正常進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）紫外吸收定量測(cè)試260nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值，根據(jù)公式(1)計(jì)算DNA濃度。DNA濃度(μg/mL)=[A260／(L)]稀釋倍數(shù)…………………………(1)式中：A260－被測(cè)樣品在260nm下的吸光度值 L－比色池厚度，單位cm。（3）基因組DNA完成定量測(cè)試后，稀釋到50 ng/181。L備用。9 微衛(wèi)星引物篩選 微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已有序列設(shè)計(jì)引物利用GenBank上的已注冊(cè)的物種的微衛(wèi)星序列，參照引物設(shè)計(jì)的原則，用Primer 。 利用文獻(xiàn)中已公開的引物10 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體積均為25 mL，按表1配制PCR反應(yīng)體系。表1 微衛(wèi)星標(biāo)記—PCR反應(yīng)體系試劑反應(yīng)體系PCR Buffer (10180。) mLMgCl2 (25mmol/L)2 mL正向引物 (2pmol/μL) mL反向引物 (2pmol/μL) mLdNTPs (25mmol/L) mLrTaq (5U/mL) mLDNA (50ng100ng)3 mL超純水 mL PCR反應(yīng)程序按表2設(shè)置程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。表2 微衛(wèi)星標(biāo)記—PCR反應(yīng)程序階 段溫 度時(shí) 間194 oC5 min294 oC30–60 s50–62 oC30–60 s72 oC30–60 s35個(gè)循環(huán)372 oC10 min44 oC保存11 聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物 聚丙烯酰胺凝膠凝膠的制備 制膠裝置的準(zhǔn)備彈簧夾、干膠架、膠板和隔板、手套、鯊魚齒梳子、隔板、燒杯和攪棒。 膠板的按置（1）用KOH或乙醇清洗玻板上的污漬（2）用溫的去污劑溶液洗滌玻璃板和間隔片，用自來水徹底沖洗，再用去離子水洗凈。用乙醇沖洗玻璃板去掉水印，并放于一旁晾干（必須洗凈玻璃板，以確保灌膠時(shí)不會(huì)產(chǎn)生氣泡）。（3）把大塊玻璃板放在空的試管架上，把隔片放在玻璃板的兩邊。（4）再將較?。ɑ驇О伎冢┑牟ＡО逶陂g隔片上放置妥當(dāng)，對(duì)齊隔片。（5）用彈簧夾將三邊夾住，用瓊脂糖膠液封好邊。（6）將梳子放在膠模的敞開端并檢查是否貼切適合，取出梳子將空膠模放在實(shí)驗(yàn)桌上。 制膠（1）在桌上放好空膠模。（2）將按附錄A配制的30ml8%凝膠儲(chǔ)存液中加入80 μL過硫酸銨，20 μL TEMED，用攪棒混勻溶液（不得有氣泡），將膠模放在架片成45度角，然后用玻棒引流緩緩灌入溶液。緩緩灌入膠模中。（3）立即將鯊魚梳子的平整側(cè)插入凝膠溶液中，梳子兩端插入面應(yīng)等同。（4）平放在實(shí)驗(yàn)桌上，等其聚合完畢后，可立即使用或保存于室溫達(dá)24 h。 裝備裝膠（1）慢慢地從凝膠上移走梳子和彈簧夾以
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