db21t18613-20xx水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗技術(shù)規(guī)程簡單重復(fù)序列間區(qū)擴增法(編輯修改稿)
2025-05-01 23:02 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 低溫高速離心機 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 單道可調(diào)移液器（，10mL，20mL，100mL，200mL，1000mL） 電子天平（） 水浴恒溫震蕩器 電泳槽 普通離心機 紫外分光光度計 超聲波清洗器 超純水器 北京六一儀器廠DYYⅢ型電泳儀7 采樣 樣品類型Ⅰ型：毛發(fā)、皮毛類（儒艮、中華白海豚、斑海豹、海龜）； Ⅱ型：肌肉、肝臟組織類（仿刺參、海膽、虹鱒、大菱鲆、鰻鱺、中國對蝦、日本對蝦、中華絨鰲蟹、三疣梭子蟹、皺紋盤鮑、海灣扇貝、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、文蛤、牡蠣、海蜇等）； Ⅲ型：藻類（海帶、裙帶菜、鼠尾藻等）。 采樣方法應(yīng)在自然保護機構(gòu)、人工養(yǎng)殖部門等協(xié)助下進行，以不傷害個體、不破壞其生境為原則，采集其毛發(fā)、皮毛等作為樣品，特殊情況（如出現(xiàn)受傷個體等）可酌情采取其他部位（如肌肉、肝臟等）。樣品數(shù)量應(yīng)不少于10個/群體。所采樣品標(biāo)注后，妥善存放，防止污損，做好采樣記錄。隨機采取正常、健康個體樣品，數(shù)量不少于30個/群體。樣品標(biāo)注后，活體運至實驗室。8 分析步驟 樣品固定 Ⅰ型樣品將樣品先用70%乙醇洗1次，再用超純水沖洗2次，20℃保存?zhèn)溆谩?Ⅱ型樣品從活體中直接采集肌肉或臟器組織， 20℃冰箱直接凍存。 Ⅲ 型樣品選取幼嫩藻尖，用毛筆在無菌海水中充分刷洗，解剖鏡下觀察，確定沒有附生雜藻后，在無菌蒸餾水中清洗，晾干備用。 DNA提取 Ⅰ型樣品在200μL 離心管中放入1~4根毛發(fā)，毛囊置于離心管底部，剪去高于離心管部分的毛發(fā)，設(shè)置一個空白對照管；在每個離心管中加入15μL配制好的毛囊裂解液。毛囊裂解液用1PCR緩沖液(50mmol/L KCl，10mmol/L TrisHCl，%明膠)，加MgCl2至2mmol/L，蛋白酶K 20mg/L；在PCR儀上設(shè)置一個單循環(huán)程序：65℃ 30min，95℃ 15min，4℃ 10min；將上一步驟中的離心管放入預(yù)熱好的PCR儀中，運行該程序。程序結(jié)束后，將離心管進行瞬時離心，20℃保存?zhèn)溆谩?Ⅱ型樣品取20℃，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/L TrisHCl，pH ，75mmol/L NaCl，%SDS，5mmol/L EDTA)。振蕩均勻后，65℃水浴1h；按GB/T ，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；用適當(dāng)50
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