【文章內(nèi)容簡介】 菌根的類別 菌根包括外生菌根和內(nèi)生菌根兩大類。 （ 1）外生菌根：外生菌根是真菌菌絲穿入外皮層的細胞間隙，形成一個真菌菌絲網(wǎng)，并圍繞著根相互編織覆蓋起來，形成鞘狀菌根。菌絲由鞘向外延伸并穿透周圍土壤，受侵染的根系常常完全為菌絲所覆蓋。 （ 2）內(nèi)生菌根：內(nèi)生菌根的菌絲既生長在皮層細胞內(nèi)，也可生長在細胞間隙中，真菌套延伸到土壤里。內(nèi)生菌根中最常見的是一種孢囊叢枝狀菌根 (vesicular arbuscular mycorrhizal, VAM)。這種菌根生長在皮層中，并常常帶有富含類脂的圓卵形球狀體（囊泡），而且高度分枝，在寄主細胞內(nèi)形成類吸喙結(jié)構(gòu)（叢枝），用于養(yǎng)分轉(zhuǎn)移。該類真菌屬于內(nèi)囊霉科(Endogonaceae)，主要的屬是屬 Glomus，是土囊真菌中最多的一類。 菌根的作用 菌絲可代替根毛，增加根吸收水分和養(yǎng)分；菌絲呼吸釋放大量的 CO2，溶解后成為碳酸，促進土壤難溶物質(zhì)溶解。此外，菌絲還能產(chǎn)生維生素 B1（硫胺素）、 B6（吡醇類），促進根系發(fā)育。另外，菌根也依賴寄主供應碳水化合物、氨基酸、維生素和其他有機物質(zhì)。與根發(fā)生共生關(guān)系的真菌無嚴格的專一性。 菌根促進磷的吸收和改善磷營養(yǎng)，是菌根植物生長與產(chǎn)量得以增加的主要原因。 以單位根長計算，菌根比非菌根可以多吸收幾倍的磷。因為菌絲的生長增加了吸收表面積，菌絲可達到距根表面數(shù)厘米的地方，使根的吸磷范圍超過根際磷耗竭區(qū)。已經(jīng)有報道表明， VA菌根的菌絲將磷從土壤運輸?shù)郊闹鞲毎嚯x可長達 8cm。菌根對磷營養(yǎng)的主要作用是加快對難溶磷的吸收速率。菌絲呼吸釋放大量的 CO2，溶解后成為碳酸，促進土壤難溶磷化合物（如磷酸鈣）溶解。真菌膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對磷的親和力比寄主根系的高，使真菌菌根有較高的磷吸收效率。 ? 由于菌絲以較高的速率吸收土壤中的磷，促進鄰近的土壤和肥料中一些難溶性無機磷化合物的溶解作用，紅辣椒地上部干重明顯增加。而與紅辣椒相反，向日葵利用難溶性磷的能力很強，因此盡管其菌根的發(fā)育較好，而且磷的吸收也顯著增加，但是 VA菌根的侵染并未明顯表現(xiàn)出促進生長的效應。表明菌根依存性的基因型差異可歸結(jié)于各種因素。 菌根從土壤中吸收磷并轉(zhuǎn)運到植物體的分子生物學 Harrison 等 1995年首次分離到了一種孢囊叢枝狀真菌 Glomus versiforme的細胞跨膜磷酸鹽載體基因 (gvpt)，并對其載體結(jié)構(gòu)及吸收磷酸鹽的分子機制進行了研究。 其方法是：制備豆科植物苜蓿（ Medicago truncatula） 與真菌 G. versiforme的共生菌根cDNA文庫，以酵母 (Saccharomyces cerevisidae)的 pho84基因為探針，從該基因文庫中分離到一個cDNA克隆 (gvpt)，全長 1932 bp ，在閱讀框 (ORF)的 5’ 末端和 3’ 末端不轉(zhuǎn)錄序列分別為 112bp和257bp長。編碼蛋白 521個氨基酸，是一個膜蛋白(integral membrane protein)，包含有 12個跨膜結(jié)構(gòu)域 (membrane spanning domain)，與所有真核生物（ eukaryote）和原核 (prokaryote)膜轉(zhuǎn)運體有相似的二級結(jié)構(gòu) (secondary structure)。 GVPT的氨基酸序列與 Pho84有 %的同源性，與 Pho5有 45%的同源性它們之間最保守的序列區(qū)包括有激酶 C(kinase C)和酪蛋白激酶II (casein kinase II)的磷酸化位點(phosphorylation site)。 gvpt 是從有兩個基因組（植物和真菌）的 cDNA文庫中鑒定出來的，因此，可能來自于共生體的任何一個基因組。用 M. truncatula 基因組 DNA進行Southern印跡分析發(fā)現(xiàn)， gvpt不是寄主植物的基因。由于 G. versiforme是寄生的，純真菌材料難以得到，因此用 gvpt的特異序列設計引物，對 G. versiforme的基因組 DNA進行 PCR擴增。擴增片斷進行序列分析，發(fā)現(xiàn)與 gvpt相同，同時 PCR擴增共生菌根 (M. truncatula, G. versiforme) DNA，得到同樣的 DNA片段，而從沒有菌絲的 M. truncatula 根系沒有擴增到這樣的片段。由此，證明 gvpt是真菌上的基因。 pho84缺失突變體缺乏高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運體，不能在低濃度的磷條件下吸收磷酸鹽甚至在高濃度磷酸鹽時可產(chǎn)生抑制性酸性磷酸酶，而且這種現(xiàn)象很容易檢測到。因為 pho84突變體 NS219細胞容易染紅，而野生型仍是白色，可在介質(zhì)中生長。將gvpt cDNA連接到一個酵母表達載體 pAAH5上轉(zhuǎn)移到 pho84突變的酵母 NS219株系上， gvpt在 NS219細胞中表達，使 NS219顯示出野生型的酸性磷酸酶活性，表現(xiàn)形式仍然是白色的，表明 gvpt的表達互補了 pho84缺失突變體的表現(xiàn)型，表達載體沒有g(shù)vpt序列的 NS219轉(zhuǎn)化體，顯示 pho84缺失突變體的表現(xiàn)型，染色為暗紅色。這一試驗充分證明，gvpt是一個編碼功能性磷酸鹽載體的基因。 孢囊叢枝狀真菌 G. margarita菌絲的磷酸鹽吸收也有兩個吸收系統(tǒng)： 主動的高親和力系統(tǒng) 被動的低親和力系統(tǒng) 原位雜交試驗證明： gvpt不是在根內(nèi)的真菌菌絲中表達，而是在分枝于根外部的菌絲中表達。收集菌根完整的外部菌絲， gvpt轉(zhuǎn)錄物進行反轉(zhuǎn)錄分析（ reverse transcription, RTPCR)，含有內(nèi)部菌絲的根組織 gvpt轉(zhuǎn)錄非常低， gvpt轉(zhuǎn)錄物主要存在于根的外部菌絲中，其中的 gvpt轉(zhuǎn)錄物高出內(nèi)部 30倍。表明外部菌絲是基因表達的主要部位。 高磷吸收和低磷吸收系統(tǒng)的區(qū)別 高磷吸收 低磷吸收 條件 外界低磷 外界高磷 能量 需要能量 不需要 磷流動的方向 逆向 正向 作用方式 主動 被動 一、吸收磷的特點 途徑 生長介質(zhì)中的磷通過根毛和表皮細胞進入皮層，再由內(nèi)皮層通道細胞進入中柱，沿中柱木質(zhì)部運送至地上部，從而分配到地上部不同的器官。 吸收運轉(zhuǎn)的控制點 磷通過細胞質(zhì)膜進入根表皮及皮層細胞共質(zhì)體； 載入根系中柱的木質(zhì)部。 隨生長環(huán)境中磷濃度的降低，根系及細胞對磷的吸收能力增強 表明植物對低磷脅迫具有適應機制。 第四節(jié) 高等植物磷吸收轉(zhuǎn)運系統(tǒng) 二、擬南芥高親和磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)運體基因及表達 分離到的基因 AtPT AtPT PHT PHTPHT3。其中前兩者是最早分離到的高親和磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)運體基因。 AtPT AtPT2分離方法 原理是利用相似功能基因具同源性，即可以用功能相似的基因作為探針進行文庫篩選，獲得陽性克隆，測序新的克隆，然后將其序列與原探針克隆進行比較，分析閱讀框，看是否新克隆到的序列具有完整的基因結(jié)構(gòu)，如有的話，即達到了新的基因克隆的目的。 Bun Ya等 1991年利用酵母的 pho84基因篩選擬南芥根系磷脅迫誘導 cDNA文庫。 AtPT1為 1754bp長的核苷酸序列，其閱讀框編碼 524個氨基酸的多肽，分子質(zhì)量。 AtPT2是 1897bp長的核苷酸序列，其閱讀框架編碼 534個氨基酸的多肽，分子質(zhì)量。兩者在編碼區(qū)的核苷酸序列同源性達70%，編碼的氨基酸有 78%的同源性。 三、低磷脅迫誘導核糖核酸酶基因 核糖核酸酶（ RNase） 它是一種 RNA水解酶，活性最適 pH為 ，蛋白質(zhì)等電點 ，對EDTA()不敏感，分子質(zhì)量為 22kDa。實際上，它是一種磷酸基團轉(zhuǎn)移酶(phosphotransferase)，對單磷酸二核糖核苷具有水解作用。如對鳥嘌呤尿嘧啶二核苷 GpU的酶解作用，